BMSCs來源外泌體調節表皮HaCaT細胞及對燒傷創面愈合的促進作用

唐強　黃志群　廖秋姣　陳端凱　陸鋼　姜艷　唐乾利

[摘要]目的：探討骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的外泌體對表皮細胞（HaCaT細胞）增殖、侵襲與遷移的影響，以及對小鼠燒傷創面愈合的作用。方法：分離培養小鼠的BMSCs，超速離心法收集BMSCs來源的外泌體，采用BMSCs來源的外泌體培養HaCaT細胞，CCK-8法檢測BMSCs來源的外泌體對HaCaT細胞增殖的影響，細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測BMSCs來源的外泌體對HaCaT細胞遷移與侵襲的影響。選取25只C57BL/6小鼠構建燒傷模型，22只成功建模，將存活小鼠分為對照組和外泌體組，每組11只，外泌體組燙傷周圍注射BMSCs來源的外泌體，對照組小鼠同時注射等體積PBS溶液。采用Image J軟件分析小鼠創面愈合率，通過HE染色觀察創面組織學變化，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測創面組織中炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-10（IL-10）的水平，免疫組織化學染色檢測創面組織Ⅰ型膠原（Col Ⅰ）和Ⅲ型膠原（Col Ⅲ）表達。結果：成功分離培養出小鼠BMSCs，并得到BMSCs來源的外泌體。與對照組比較，實驗組HaCaT細胞增殖活性明顯升高;細胞的劃痕愈合率較對照組顯著升高，細胞侵襲數目較對照組也顯著增加，差異均具有統計學意義（P<0.05）。與對照組小鼠比較，經BMSCs來源的外泌體處理的小鼠，第3、7、14、21、28天的創面愈合率顯著升高，創面組織結構得到明顯改善，且組織中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量均顯著降低，而抗炎因子IL-10的含量顯著升高，Ⅲ型膠原表達明顯，差異均具有統計學意義（P<0.05）。結論：BMSCs外泌體可促進HaCaT細胞的增殖、侵襲與遷移能力，并減輕小鼠燒傷創面組織的炎癥程度，促進創面愈合。

[關鍵詞]燒傷;骨髓間充質干細胞;外泌體;HaCaT細胞;創面愈合

[中圖分類號]R644? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）09-0001-06

Exosomes Derived from BMSCs Regulate Epidermal HaCaT Cell and Promote Burn Wound Healing

TANG Qiang1，HUANG Zhi-qun1，LIAO Qiu-jiao2，CHEN Duan-kai1，LU Gang1，JIANG Yan3，TANG Qian-li3

（1.Department of Burn Plastic Surgery and Wound Repair Surgery;2.Department of Spine and Bone Surgery，Affiliated Hospital of Youjiang Medical College for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China;3.Youjiang Medical College for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of exosomes secreted by bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） on the proliferation， invasion and migration of human keratinocytes （HaCaT cells）， and on the healing of burn wounds in mice. Methods? BMSCs from mice were isolated and cultured， exosomes derived from BMSCs were collected by ultracentrifugation， HaCaT cells were cultured with exosomes derived from BMSCs， and the effect of exosomes derived from BMSCs on the proliferation of HaCaT cells was detected by CCK-8 method. Scratch test and Transwell test were used to detect the influence of BMSCs-derived exosomes on HaCaT cell migration and invasion. Twenty-five C57BL/6 mice were selected to construct a burn model. After successful modeling （n=22）， the surviving mice were divided into a control group and an exosome group， with 11 in each group. Exosomes derived from BMSCs were injected around the scald in the exosomes group， and mice in the control group were injected with an equal volume of PBS solution at the same time. Image J software was used to analyze the wound healing rate of mice， and the histological changes of the wound were observed by HE staining. Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of inflammatory factors tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-10 （IL-10） in wound tissue. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of type Ⅰ collagen （Col Ⅰ） and type Ⅲ collagen （Col Ⅲ） in wound tissue. Results? The mouse BMSCs were successfully isolated and cultured， and exosomes derived from BMSCs were obtained. Compared with the control group， the HaCaT cell proliferation activity in the experimental group was significantly increased; the scratch healing rate of the cells was significantly higher than that of the control group， and the number of cell invasion was also significantly higher than that of the control group. The differences were statistically significant （P<0.05）. Compared with control mice， mice treated with BMSCs-derived exosomes had a significantly higher wound healing rate on days 3， 7， 14， 21 and 28， the tissue structure of the wound was significantly improved， and the contents of pro-inflammatory factors TNF-α and IL-1β in the tissues are significantly reduced， while the content of anti-inflammatory factor IL-10 is significantly increased. The expression of type Ⅲ collagen was obvious， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion? BMSCs exosomes can promote the proliferation， invasion and migration of HaCaT cells， reduce the inflammation degree of burn wound tissue in mice， and promote wound healing.

Key words： burn; bone marrow mesenchymal stem cells; exosomes; HaCaT cells; wound healing

燒傷是一種極其復雜的外傷性疾病，根據世界衛生組織（WHO）統計，每年大約有30多萬人因燒傷致使死亡，并造成1 000多萬傷殘調整壽命年的損失[1-2]。燒傷后皮膚發生變性，引起組織形態發生變化、細胞代謝紊亂和功能受損，而燒傷后傷口愈合也是一個復雜的過程，涉及炎癥、增殖和重塑三個階段[3]，促進皮膚傷口愈合的目標是快速再生皮膚的天然保護結構，以減少感染的風險并提供組織的功能性[4]。人永生化表皮細胞HaCaT在創傷及周圍部分的增殖與遷移是創面再上皮化和創面修復的關鍵環節之一[5]。

目前，燒傷的治療方法主要包括基因治療、生長因子治療、富血小板血漿治療、干細胞治療和組織工程[6]。其中，基于干細胞的療法是治療急性和慢性傷口愈合的重要途徑。研究表明，骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）可用于多種疾病的治療，同時能夠分泌有利于細胞修復和生長的營養因子[7]。為進一步探索基于BMSCs外泌體的治療方法，本研究通過提取BMSCs來源的外泌體，觀察其對HaCaT細胞功能學的影響，并在燒傷小鼠上初步觀察了其對創面愈合的作用，為后續BMSCs來源的外泌體治療創面損傷的機制研究提供依據。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 實驗動物：健康清潔級雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體質量18～24g，均在右江民族醫學院動物中心實驗室飼養。

1.1.2 主要材料、試劑：HaCaT細胞株（北京協和細胞資源中心），胎牛血清、青霉素-鏈霉素、DMEM培養液及胰蛋白酶（美國Gibco 公司），ELISA檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），HE染色試劑和免疫組化染色試劑（北京索萊寶），茜素紅染色試劑盒和油紅O染色試劑盒（北京中杉金橋），成骨和成脂分化培養基（中國賽業），CCK-8試劑盒（日本同仁），Transwell小室（美國 System Biosciences 公司），抗體CD34、CD29、CD45、CD44、Col Ⅰ和Col Ⅲ（英國Abcam 公司），其他試劑均為國產分析純。

1.2 BMSCs的分離、培養及鑒定：采用全骨髓貼壁法提取C57BL/6小鼠的BMSCs。將小鼠脫臼處死，在無菌環境下分離兩側股骨和脛骨，PBS沖洗骨髓腔，細胞濾網過濾，制成細胞懸液。將細胞懸液用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM培養液原代培養，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中，每2d換液1次，去除未貼壁細胞。待細胞融合度達到80%時，0.25%胰蛋白酶消化。收集第3代BMSCs，1 000rpm/min離心5min，制成細胞懸液并調整濃度為1×105個/毫升，通過流式細胞術檢測CD34、CD29、CD45、CD44表達。第3代BMSCs分別使用成骨完全培養基誘導21d和成脂分化培養基誘導14d后，進行茜素紅染色和油紅O染色。

1.3 BMSCs的外泌體提取及鑒定：取生長狀態良好的第3代BMSCs，PBS漂洗后，用無血清DMEM培養基培養48h，收集培養上清液，4℃離心機中以300g離心10min，取上清液，以2 000g離心20min，取上清液，繼續以10 000g離心30min，留取上清液，濾膜過濾，再以100 000g離心1.5h，棄去上清液得到外泌體沉淀，加入PBS重懸，獲得外泌體懸液。采用透射電子顯微鏡觀察外泌體，NTA測量外泌體的直徑與濃度，Western blot檢測BMSCs外泌體蛋白標志物Alix、TSG101、CD9表達。

1.4 HaCaT細胞培養、分組及處理：HaCaT細胞復蘇后，加入含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養，待細胞融合度達到約80%時，加入0.25%胰蛋白酶消化，并以1：3的比例進行傳代培養，后續實驗選取生長狀態較好的細胞進行。

1.5 CCK-8實驗：將HaCaT細胞以1×104個/孔的密度接種到96孔板中，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養24h。將細胞隨機分為對照組和實驗組，對照組細胞在DMEM培養基中繼續培養，實驗組細胞使用含10μg/ml BMSCs來源的外泌體的DMEM培養基培養，分別于培養0、1、3、5、7d時，每孔加10μl CCK-8，繼續孵育4h，采用酶標儀檢測450nm處各孔吸光光度值。

1.6 Transwell實驗：在Transwell小室的上室加50μl稀釋的Matrigel膠，放于37℃培養箱中待膠凝固。將HaCaT細胞分組處理48h后，調整濃度為2×104個/毫升。取100μl細胞懸液加入Transwell小室的上室，對照組的下室加入含10%胎牛血清的完全培養液，實驗組的下室加入含10μg/ml外泌體的完全培養基。置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育24h，棄培養液，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，PBS洗滌并封片，在光學顯微鏡下觀察并拍攝圖像，統計侵襲細胞數目。

1.7 細胞劃痕實驗：將HaCaT細胞分組處理48h后，調整細胞濃度以4×105個/孔接種在6孔板中培養24h，用移液管尖端沿直尺垂直于培養孔背后的中間處劃一道痕，PBS清洗細胞，并沖掉劃痕下細胞，添加無血清DMEM培養基，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中繼續培養，分別于0h和48h時，在光學顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍攝圖像，采用Image J軟件分析劃痕愈合情況。

1.8 動物造模、分組與處理：小鼠通過腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，剔除背部毛，大小為2cm×2cm。將小鼠在燙傷板上固定后，背部剃毛區域皮膚均勻涂抹無水酒精，涂抹后立即點燃，15s后迅速撲滅，即制成深Ⅱ度燒傷小鼠模型，接著腹腔注射0.5ml乳酸林格液，將小鼠單籠飼養，期間自由飲水和攝食。造模后，25只小鼠中有3只死亡，將余下22只小鼠隨機分為對照組和外泌體組，每組11只，外泌體組小鼠在燙傷周圍注射1ml PBS溶液重懸的BMSCs來的外泌體（0.2mg/ml），對照組小鼠同時注射等體積PBS溶液。

1.9 燒傷創面愈合率：小鼠造模并進行相應處理后，在第3、7、14、21、28天觀察創面愈合情況，以透明紙和方格紙描畫出創面大小，Image J軟件分析創面面積，創面愈合率（%）=[（初始創面面積﹣測定創面面積）/初始創面面積]×100%，以確定傷口愈合程度。

1.10 HE染色：在BMSCs來源的外泌體處理后第7、14、21、28天，取小鼠創面組織樣本進行組織病理學評估，將創面組織在4%多聚甲醛固定后，經漂洗、脫水處理，常規石蠟包埋后進行切片，以獲得厚度為5μm的石蠟切片。取部分切片常規行HE染色，通過顯微鏡觀察創面組織學變化情況。

1.11 ELISA檢測：在BMSCs來源的外泌體處理后第28 天，取小鼠創面組織制成組織勻漿，4 000rpm/min離心10min，獲取上清液，采用ELISA測定組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-10的水平，步驟嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.12 免疫組織化學染色：創面組織石蠟切片脫蠟、脫水后，使用0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）在微波爐中進行高溫抗原修復，室溫冷卻，加入內源性過氧化物酶處理15min，室溫下5%山羊血清封閉1h，加入稀釋的兔抗Col Ⅰ（1：500）與Col Ⅲ（1：500）為第一抗體，置于4℃下孵育過夜，第2天，PBS洗滌，加入稀釋的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（1：1 000），37℃下孵育30min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片，通過顯微鏡下觀察并拍攝圖像，Image J軟件對圖像進行測定分析。

1.13 統計學分析：采用SPSS 27.0統計軟件對本研究數據進行分析處理，計量資料采用均數±標準差（x?±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 骨髓間充質干細胞鑒定結果：通過流式細胞儀檢測BMSCs上細胞表面抗原CD34，CD29，CD45以及CD44的表達，結果顯示，CD29和CD44呈陽性表達，而CD34和CD45呈陰性表達（見圖1A）。倒置顯微鏡下觀察到BMSCs形態均勻，細胞呈紡錘形，并呈螺旋狀排列（見圖1B）。BMSCs油紅O染色結果顯示，在細胞內部可觀察到紅色的脂滴（見圖1C）。茜素紅染色觀察到有明顯的橘紅色鈣沉淀，說明有鈣結節形成（見圖1D）。

2.2 外泌體的鑒定：透射電鏡下外泌體形態為杯狀或球形（見圖2A）。直徑大小分布在0～200nm，粒徑峰值為50nm，平均直徑為（75.5±1.4）nm，濃度為（1.57±0.09）×1 010/ml（見圖2B）。Western blot檢測結果顯示，外泌體標志蛋白TSG101、Alix、CD9均表達陽性（見圖2C）。結果表明這些納米顆粒為外泌體。

2.3 BMSCs來源的外泌體促進HaCaT細胞增殖：CCK-8檢測結果顯示，與對照組比較，在培養3、5、7d時，經過與BMSCs來源的外泌體共培養的實驗組HaCaT細胞增殖活性顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

2.4 BMSCs來源的外泌體促進HaCaT細胞遷移與侵襲：細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測結果顯示，HaCaT細胞經過與BMSCs來源的外泌體共培養后，細胞的劃痕愈合率及細胞侵襲數目較對照組顯著增加，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖4～5。

2.5 BMSCs來源的外泌體促進小鼠燒傷創面愈合：各組小鼠燒傷創面愈合率檢測結果顯示，經過BMSCs來源的外泌體處理的小鼠，在第3、7、14、21、28天，創面愈合率較對照組均顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖6。

2.6 BMSCs來源的外泌體減輕小鼠燒傷組織損傷程度：HE染色結果顯示，在燒傷后第7天，對照組皮膚組織壞死，纖維組織大量增生，炎癥細胞浸潤十分明顯，而外泌體組炎癥細胞浸潤較少且分布較為均勻，有新肉芽組織形成;燒傷后第14天，對照組有新肉芽組織形成，并伴隨炎性細胞浸潤，外泌體組炎性細胞浸潤輕微，上皮組織增生明顯;燒傷后第21天，對照組上皮組織增生，炎癥反應較輕，外泌體組纖維組織增生較少，可見組織再生;燒傷后第28天對照組纖維組織增生較少，外泌體組皮膚壞死明顯恢復，組織結構較為完整。見圖7。

2.7 BMSCs來源的外泌體調控炎性因子表達：ELISA檢測結果顯示，與對照組比較，外泌體組小鼠創面組織中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量均顯著降低，而抗炎因子IL-10的含量顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.8 BMSCs來源的外泌體對Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達的影響：免疫組化染色結果顯示，對照組創面組織中Ⅰ型膠原表達較外泌體組創面組織中Ⅰ型膠原表達更為明顯，而外泌體組中的Ⅲ型膠原較對照組中的Ⅲ型膠原表達更為明顯（見圖8）。

3? 討論

燒傷形成的創面一直被認為是最具有破壞力的創傷形式之一，通常會導致多種并發癥的發生，例如繼發性炎癥反應、組織器官衰竭和燒傷引起的一些長期后遺癥等[3]。雖然在過去的幾十年中，由于治療手段的不斷改善，燒傷患者的生存率得到了提高，但仍然存在許多挑戰，例如燒傷后患者出現的功能障礙，無法實現功能全面的皮膚再生以及重度燒傷患者因燒傷瘢痕嚴重產生心理疾病[8]。細胞療法是皮膚燒傷損傷后形態重建和功能恢復最有前途的方法之一。在不同臨床條件下優化修復過程和組織再生的細胞群體取決于多種因素，例如細胞類型、細胞培養技術、受損組織和患者的免疫反應等[9]。識別具有巨大治療潛力的豐富細胞來源特別重要，干細胞具有自我更新和分化為多種細胞類型的潛力[7]，這使得運用干細胞再生受損的組織和器官對各種病癥的治療引起了廣泛的關注。目前，干細胞作為促進皮膚再生的手段在傷口愈合領域的運用也引起了研究者們較大的興趣。

越來越多的證據表明，BMSCs參與了癌癥微環境的形成，其在腫瘤進展中的潛在作用是通過分泌的旁分泌因子所介導的[10]。外泌體是直徑大小40～150nm的細胞外膜囊泡，廣泛存在于所有生物流體中，包括血漿、尿液、唾液、母乳以及支氣管肺泡灌洗液，當多囊泡體與質膜融合時，外泌體就會釋放到細胞外環境中去[11]。外泌體作為一種旁分泌因子，外泌體可以參與生物化學物質的運輸，例如細胞因子、mRNA、非編碼RNA以及蛋白質[12]，可通過遺傳物質的轉移在細胞遺傳信息交換中發揮至關重要的作用。因此，外泌體在調節細胞存活和組織修復中也起到了關鍵作用。郭建忠等研究表明了血清來源的外泌體可以促進成纖維細胞的增殖和表皮HaCaT細胞的遷移，這使得其對小鼠燙傷傷口的愈合也產生了良好的促進作用[13]。Zhang等證明了脂肪組織衍生的干細胞通過產生外泌體激活PI3K/Akt信號通路，從而加速皮膚傷口的愈合[14]。Li等通過表明MSCs衍生的外泌體lncRNA H19通過削弱miR-152-3p介導的對PTEN抑制作用來預防成纖維細胞的凋亡，通過注射MSCs來源的外泌體lncRNA H19后，糖尿病足潰瘍小鼠的傷口愈合明顯加快[15]。

在本研究中，從BMSCs分離到了50～200nm的生物活性成分，經過鑒定發現，這些顆粒中TSG101、Alix及CD9蛋白均呈現陽性表達，結果均符合外泌體特征，由此判斷成功分離到BMSCs來源的外泌體。燒傷后變性的真皮具有通過改善周圍微環境而恢復正常皮膚形態并促進傷口愈合的能力。在變性真皮中的血管內皮細胞在血管新生具有重要作用，表皮細胞在表皮修復中通過增殖和再上皮化發揮著關鍵作用，燒傷后數小時內上皮再形成過程開始，這對于恢復完整的表皮屏障作用來說至關重要[16]。本研究結果顯示，通過BMSCs來源的外泌體作用于表皮細胞HaCaT后，細胞的增殖、侵襲與遷移能力均明顯提高，這一結果提示HaCaT細胞行為可能與BMSCs來源的外泌體有直接關系，因此可能在創面愈合中發揮有益作用。

燒傷后炎癥介質在體內釋放增加，這會引起過度的全身炎癥反應，從而導致病理變化過程中的血管通透性增加。促炎細胞因子TNF-α和IL-β在細胞因子網絡和全身性炎癥中起著重要作用，他們不僅可以引起細胞因子的釋放，而且可以增強嗜中性粒細胞和內皮細胞的黏附以及嗜中性粒細胞的遷移，從而進一步加重了器官的損傷[17-18]。抗炎細胞因子IL-10具有重要免疫調節功能，能夠通過活化的巨噬細胞來抑制炎性細胞因子如TNF-α、IL-6的表達[19]。這些炎性因子的表達水平通常是燒傷治療后檢測的重要指標之一。在本研究中，注射BMSCs來源的外泌體的燒傷小鼠皮膚組織中觀察到，創面組織愈合加快，組織修復較為明顯，同時TNF-α、IL-1β的含量降低而IL-10的含量升高，由此說明，BMSCs來源的外泌體可抑制小鼠燒傷后的炎癥反應，加快創面的愈合。

綜上所述，BMSCs來源的外泌體可通過抑制炎癥反應及促進表皮細胞增殖和遷移來促進小鼠燒傷后創面愈合。但外泌體中的成分復雜，具體哪些因子發揮了有益作用以及其具體機制，將在后續研究中進一步明確。

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[收稿日期]2020-09-21

本文引用格式：唐強，黃志群，廖秋姣，等.BMSCs來源外泌體調節表皮HaCaT細胞及對燒傷創面愈合的促進作用[J].中國美容醫學，2021，30（9）：1-6.