寧波地區流動人口耐多藥肺結核二線抗結核藥物耐藥狀況及耐藥基因突變特征分析

車 洋，賀天鋒，陳 同，林 律

作為全球公共衛生熱點問題的耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)的流行和傳播給國內結核病的防控工作持續帶來嚴峻挑戰。流動人口因其流動性強、患病后治療管理困難、經濟條件差等原因一直被認為與結核病的耐藥高度相關[1-2]。寧波地處沿海經濟活躍地區，商貿活動頻繁，流動人口占比較大。因此，深入探究本地區流動人口結核病耐藥狀況對合理制定結核病防控策略具有重要意義。

二線注射類藥物卡那霉素(KAN)、阿米卡星(AMK)、卷曲霉素(CAP)和氟喹諾酮類藥物氧氟沙星(OFX)、左氧氟沙星(LVX)是MDR-TB治療的核心藥物[3-4]，但隨著這些二線抗結核藥物的廣泛使用，針對這些藥物的耐藥問題也逐年嚴峻。為深入探討本地區流動人口耐多藥肺結核患者二線抗結核藥物的耐藥狀況，本研究對2017-2019年耐藥監測期間收集的133例MDR-TB患者資料進行了分組(流動人口組56例，戶籍人口組77例)，并對所有MDR-TB患者臨床分離菌株的二線抗結核藥物耐藥相關基因rrs、tlyA、eis、gidB、gyrA、gyrB進行了檢測分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株來源 研究納入的133株MDR-TB臨床分離株收集自2017—2019年寧波地區9個縣(市、區)耐藥監測期間篩選的痰培養陽性菌株，均經過菌種鑒定及異煙肼、利福平、鏈霉素及乙胺丁醇4種一線抗結核藥物耐藥檢測。結核分枝桿菌H37RV標準株來源于中國疾病預防控制中心。耐藥相關定義[5]：耐多藥(MDR-TB)為至少同時耐異煙肼和利福平的菌株；準廣泛耐藥(quasi-extensive drug resistance, pre-XDR)為耐多藥基礎上對1種氟喹諾酮類或1種二線注射類抗結核藥物耐藥；廣泛耐藥(XDR-TB)為耐多藥基礎上至少同時對1種氟喹諾酮類和1種二線注射類抗結核藥物耐藥。

1.1.2 試劑來源 分離培養、菌種鑒定及藥敏試驗培養基均購自珠海貝索生物技術有限公司。結核分枝桿菌DNA提取、PCR擴增等相關試劑及技術服務購自上海桑尼生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離培養、菌種鑒定 按照《結核病診斷實驗室檢驗規程》[6]進行。

1.2.2 藥物耐藥性實驗 異煙肼(isoniazide，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、卡那霉素(kanamycin，KAN)阿米卡星(amikacin，AMK)、卷曲霉素(capreomycin，CAP)、氧氟沙星(ofloxacin，OFX)及左氧氟沙星(levofloxacin，LVX)的耐藥檢測采用WHO/IUATLD 《耐藥監測指南》推薦的1%比例法[7]，含藥培養基中藥物終濃度分別為INH 0.2 μg/mL、RFP 40 μg/mL、KAN 30 μg/mL、AMK 30 μg/mL、CAP 40 μg/mL、OFX 2.0 μg/mL、LVX 2.0 μg/mL。耐藥百分比=(含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基上生長的菌落數)×100%，以耐藥百分比大于1%定義為耐藥。每批次藥敏檢測采用結核分枝桿菌H37RV標準株作為質控。

1.2.3 結核分枝桿菌總DNA制備 取一接種環L-J培養基上生長狀態良好菌落溶于400 μL TE(pH 8.0)中，震蕩混勻后沸水浴15 min，12 000 g/min離心3 min取上清，置—20 ℃保存備用。

1.2.4 耐藥基因PCR擴增 6個二線抗結核藥物耐藥相關基因引物序列如表1所示，PCR反應體系總體積20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL(TIANGEN)，DNA模板1 μL(50 ng)，Forward Primer (20 mmol/L) 1 μL，Reverse Primer (20 mmol/L) 1 μL，無菌雙蒸水7 μL。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，58.5 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30次循環，72 ℃ 3 min。

表1 耐藥基因引物序列及其擴增片段Tab.1 Primer sequences for genes with drug resistance

1.6 序列分析 PCR產物送上海桑尼生物科技有限公司測序，使用MegAlign軟件對基因測序結果進行分析。參比序列為結核分枝桿菌H37RV標準株DNA序列(GenBank序列號：NC-000962)。

1.2.5 統計學分析 采用SPSS 21.0統計軟件進行統計分析，兩樣本率比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

表2 流動人口耐多藥肺結核二線抗結核藥物耐藥特征Tab.2 Characteristics of second-line anti-tuberculosis drug resistance among migratory patients with MDR-TB

表2(續)特征菌株數量及構成比[n(%)](n=133)流動人口耐多藥菌株數量及構成比[n(%)](n=56)戶籍人口耐多藥菌株數量及構成比[n(%)](n=77)χ2值P值左氧氟沙星 是39(29.32)19(33.93)20(25.97)0.9900.320 否94(70.68)37(66.07)57(74.03)準廣泛耐藥 是38(28.57)19(33.93)19(24.68)1.3600.243 否95(71.43)37(66.07)58(75.32)廣泛耐藥 是 8(6.01) 2(3.57) 6(7.79)0.4110.521 否125(93.99)54(96.43)71(92.21)耐藥基因突變 rrs基因 是 9(6.77) 5(8.93) 4(5.19)0.2470.619 否124(93.23)51(91.07)73(94.81) tlyA基因 是10(7.52) 1(1.79) 9(11.69)3.2590.071 否123(92.48)55(98.21)68(88.31) eis基因 是 2(1.50) 2(3.57) 0(0.00)0.9010.342 否131(98.50)54(96.43)77(100.00) gidB基因 是 5(3.76) 3(5.36) 2(2.60)0.1330.716 否128(96.24)53(94.64)75(97.40) gyrA基因 是46(34.59)22(39.29)24(31.17)0.9440.331 否87(65.41)34(60.71)53(68.83) gyrB基因 是 4(3.01) 2(3.57) 2(2.60)0.0001.000 否129(96.99)54(96.43)75(97.40)

表3 133株耐多藥菌株二線抗結核藥物耐藥相關基因突變特征Tab.3 Characteristics of gene mutations with second-line anti-tuberculosis drug resistance among 133 MDR-TB isolates from migratory patients

表3(續)耐藥基因二線抗結核藥物KANAMKCAPOFXLVX核苷酸突變類型氨基酸突變類型流動人口MDR-TB菌株數量(n=56)戶籍人口MDR-TB菌株數量(n=77)MDR-TB菌株總數tlyARRRRRT708GAAT-AAG,Leu236Phe011SSSSST708GAAT-AAG,Leu236Phe066SSSRST708GAAT-AAG,Leu236Phe011SSSRRT708GAAT-AAG,Leu236Phe112eisSSSSSA10TACC-TCC,Thr4Arg101SSSRRA10GACC-GCC,Thr4Arg101gidBSSSSS115位缺失C移碼突變224SSSSSA208CAGC-CGC,Ser70Arg101gyrASSSRRC269TGCG-GTG,Ala90His448SSSSSC269TGCG-GTG,Ala90His202RSSRRT271CTCG-CCG,Ser91Pro022SSSRRG280AGAC-AAC,Asp94Asn011SSSRRA281CGAC-GCC,Asp94Ala112SSSSRA281CGAC-GCC,Asp94Ala202SSSRRA281GGAC-GGC,Asp94Gly10616SSSRSA281GGAC-GGC,Asp94Gly033SSSSRA281GGAC-GGC,Asp94Gly101RRSRRA281GGAC-GGC,Asp94Gly213SSSSSA281GGAC-GGC,Asp94Gly066gyrBSSSRRT1505GGTT-GGT,Val502Gly112SSSSSG1485TCGG-CGT,Arg495Ala101SSSRSA1495GAAC-GAC,Asn499Asp011

3 討 論

肺結核疫情是全球面臨的熱點公共衛生問題，耐藥結核病尤其是MDR-TB疫情的出現使得全球結核病防控形勢變得更加嚴峻。國內流動人口原籍地多為結核病疫情高發地區，因其具有流動性強，治療依從性差，管理困難等特點，流動人口一直被認為是耐藥結核病疫情需要防控的重點人群[8]。二線抗結核藥物卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素、氧氟沙星和左氧氟沙星是治療MDR-TB的重要藥物，由于這些藥物的廣泛使用，耐二線抗結核藥物的耐多藥菌株產生及傳播，給本就嚴峻的MDR-TB疫情防控形勢帶來了更為嚴重的挑戰。

二線抗結核藥物注射劑卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素現今被臨床廣泛用于MDR-TB的治療，對這些藥物耐藥特征的研究可以為臨床MDR-TB治愈率的提高和減少廣泛耐藥結核病(XDR-TB)的產生提供重要的科學依據[9-10]。本項研究顯示，流動人口MDR-TB患者臨床分離菌株二線抗結核藥物注射劑耐藥率均較低，與相關研究相符[11-12]，與戶籍人口患者臨床分離菌株比較差異無統計學意義。這可能與部分二線抗結核注射劑副反應較大，本地區臨床使用較少有關。

編碼16S rRNA的rrs基因突變與卡那霉素與阿米卡星耐藥有關[13-14]，本次研究結果顯示，56例流動人口MDR-TB患者臨床分離菌株rrs基因突變率與戶籍人口患者臨床分離菌株比較差異無統計學意義，流動人口MDR-TB患者臨床分離菌株rrs基因點突變位點在1 401位和514位，突變類型為A1401G和A514C，與研究報道符合[15-16]。tlyA基因的開放閱讀框(ORF)內包含一個具有甲基轉移酶活性的功能基團，在結核分枝桿菌rRNA甲基化過程中起到促進rRNA成熟，促進藥物轉運的作用[17]。有研究顯示，該基因發生斷裂、缺失或突變，則細菌會對藥物產生耐藥性，且結核分枝桿菌該基因突變主要為點突變[18]。本次研究結果顯示，10株tlyA基因發生突變的菌株中(流動人口1株，戶籍人口9株)，二線注射劑耐藥的僅1株(戶籍人口)，而其余9株均為二線注射劑敏感，提示tlyA基因突變與二線注射劑的耐藥性關系無特異性。結核分枝桿菌增強胞內存活基因(enhanced invracellular survival, eis)及其編碼蛋白EIS(乙酰轉移酶家族成員)可增強結核分枝桿菌在巨噬細胞內的存活能力，有研究顯示，eis基因啟動子區域突變與二線注射劑類藥物低水平耐藥有關[19]。本次研究結果數據顯示，133株MDR-TB患者臨床分離菌株中eis基因突變僅2株(均為流動人口)，且均為二線注射劑敏感菌株，提示eis基因啟動子區域突變與二線注射劑類藥物耐藥之間關系尚不明確。廣泛存在于細菌基因組中的gidB基因編碼一種rRNA甲基轉移酶，其靶點16S rRNA的G527正常甲基化對于氨基糖苷類藥物與16S rRNA的穩定結合起到至關重要的作用[20]。Okamoto等研究發現gidB基因突變會導致16S rRNA的530環不能得到修飾而引起卡那霉素、阿米卡星等氨基糖苷類藥物耐藥，且gidB基因突變類型較為多樣，存在點突變、缺失、插入等[21-22]。本項研究發現，56例流動人口MDR-TB患者臨床分離菌株存在gidB基因缺失和點突變情況，突變類型為115位缺失C堿基及出現A208C的點突變。但發生gidB基因缺失和點突變的5株MDR-TB均為二線注射劑敏感，因此，gidB基因突變與二線注射劑類藥物的耐藥關系值得商榷。

作為耐多藥結核病治療方案中核心藥物的氧氟沙星和左氧氟沙星同屬于喹諾酮類藥物，近年來隨著我國廣泛使用喹諾酮類治療社區獲得性肺炎等肺部感染性疾病(經濟發達地區尤為常見)，造成耐喹諾酮類藥物的菌株傳播及流行[23]。本次研究結果顯示，流動人口MDR-TB患者臨床分離菌株喹諾酮類耐藥形勢依然較為嚴峻，但與戶籍人口患者臨床分離菌株比較差異無統計學意義。這一現象提示，喹諾酮類藥物在本地區MDR-TB治療方面存在藥品管控、臨床經驗用藥等不足之處，且流動人口MDR-TB人群并不是喹諾酮類耐藥的高危人群。結核分枝桿菌喹諾酮類藥物的作用靶位是DNA促旋酶，該酶由2個A亞基和2個B亞基構成的四聚體[24-25]。喹諾酮類耐藥的分子機制主要是編碼DNA促旋酶的gyr基因發生突變(gyrA和gyrB，以gyrA突變為主)，且gyr基因突變頻率在不同菌株間差異較大[26-27]。本研究結果顯示流動人口MDR-TB 患者臨床分離菌株gyrA和gyrB基因突變率與戶籍人口患者臨床分離菌株比較差異無統計學意義。133株MDR-TB患者臨床分離菌株中gyrA突變類型有5種(C269T、T271C、G280A、A281C和A281G)，其中流動人口MDR-TB 患者臨床分離菌株gyrA突變類型只有C269T、T271C和A281G 這3種。133株MDR-TB患者臨床分離菌株中gyrB突變類型有3種(T1505G、G1485T和A1495G)，其中流動人口MDR-TB患者臨床分離菌株 gyrB突變類型為T1505G和G1485T 2種。研究結果顯示，與二線注射劑耐藥相關基因相比，喹諾酮耐藥相關基因gyr基因突變類型種類最多(8種)。

總之，寧波地區流動人口MDR-TB患者臨床分離菌株雖然對二線抗結核藥物耐藥形勢較為嚴峻，但可能該人群不是本地區MDR-TB二線抗結核藥物耐藥防控的重點人群，今后在進一步加強流動人口MDR-TB患者的治療管理工作的同時，需對全體MDR-TB病例進行系統性監測和分析，掌握總體流行趨勢。