串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在陽(yáng)江市新生兒遺傳代謝性疾病臨床應(yīng)用與研究

敖東，劉恩賜，吳瑩瑩，黃曉凌，陳鳳喜

廣東省陽(yáng)江市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，廣東陽(yáng)江 529500

遺傳代謝性疾病（IMD）是由基因突變?cè)斐蓞⑴c體內(nèi)代謝的運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白、酶及膜或受體缺陷，使機(jī)體發(fā)生代謝紊亂，引起代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺所致的疾病，種類(lèi)復(fù)雜多樣，危害嚴(yán)重，大部分會(huì)引起患兒嚴(yán)重智力障礙，甚至可能病死[1-3]。目前，IMD已成為新生兒疾病篩查中重要項(xiàng)目之一，早期IMD患兒臨床表現(xiàn)缺乏典型性，診斷難度較大，易出現(xiàn)誤診，直接影響疾病的治療。早期篩查、早期確診、盡早實(shí)施對(duì)癥治療是確保新生兒健康成長(zhǎng)的重要手段。細(xì)菌抑制法、酶聯(lián)免疫法、熒光法、時(shí)間分辨熒光法等是臨床篩查新生兒IMD的傳統(tǒng)手段，但一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)一種疾病，篩查效率較低[4-5]。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可篩查出氨基酸代謝異常、有機(jī)酸代謝異常和脂肪酸代謝異常等疾病，能夠同時(shí)檢測(cè)至少30種疾病標(biāo)志物，逐漸被應(yīng)用于新生兒IMD的篩查中[6-7]。該研究整群選擇2019年7月—2020年12月期間在陽(yáng)江市婦幼保健院和該市另外18家醫(yī)院統(tǒng)一將標(biāo)本送至陽(yáng)江市新生兒疾病篩查中心接受IMD篩查的新生兒12 409例為研究對(duì)象，分析串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在新生兒IMD臨床應(yīng)用效果，以期為臨床提供參考依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群選擇在陽(yáng)江市婦幼保健院和該市另外18家醫(yī)院統(tǒng)一將標(biāo)本送至陽(yáng)江市新生兒疾病篩查中心接受IMD篩查的新生兒12 409例為研究對(duì)象，出生日齡3～8 d，平均出生日齡（3.61±0.43）d；男7 080例，女5 329例；足月分娩11 846例，早產(chǎn)兒563例。該研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。入組新生兒家長(zhǎng)均對(duì)該研究知情，自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

①標(biāo)本采集。所有新生兒均在出生后3 d后接受IMD篩查，且充分哺乳≥6次。按摩或熱敷新生兒足跟，并用75%乙醇消毒皮膚后，待乙醇完全揮發(fā)后，使用一次性采血針刺足跟內(nèi)或外側(cè)，處深度＜3 mm，用干棉球拭去第1滴血，取第2滴血，將Whatman 903標(biāo)準(zhǔn)濾紙片接觸血滴，使血自然滲透至濾紙背面形成血斑，確保濾紙上血斑直徑＞0.8 mm，至少采集3個(gè)血斑。血片懸空平置，自然晾干呈深褐色，置入統(tǒng)一專(zhuān)用的標(biāo)本采集塑料袋內(nèi)，保存于2～8℃冰箱內(nèi)，盡快送檢。②串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)：使用美國(guó)SCIEX公司的SCIEX API 3200串聯(lián)質(zhì)譜分析儀測(cè)定血斑中的脂肪酸、氨基酸、有機(jī)酸等指標(biāo)及其比值，首先用打孔器將空白濾紙片、高低質(zhì)控制品和標(biāo)本打出直徑為3 mm的血斑，置入96孔聚丙烯板孔內(nèi)，在孔內(nèi)加入含有氨基酸、酰基肉堿同位素內(nèi)標(biāo)工作液，每孔100μL，封膜，45℃環(huán)境下，孵育震蕩45 min，650～750 r/min，再提取75μL上清液，置入V型底檢測(cè)板內(nèi)，用鋁膜覆蓋，最用SCIEX API 3200系統(tǒng)檢測(cè)。廣州豐華公司提供實(shí)驗(yàn)過(guò)程所用質(zhì)控品和試劑盒，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按儀器、試劑操作說(shuō)明書(shū)篩查。見(jiàn)表1、表2。

表1 各種氨基酸的參考值范圍

表2 各種肉堿的參考值范圍

1.3 可疑病例確診試驗(yàn)

對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查初篩陽(yáng)性者實(shí)施生化、血常規(guī)、血氨、血糖、血同型半胱氨酸、丙酮酸、尿有機(jī)酸和尿酮體檢測(cè)，并實(shí)施基因分析和血?dú)夥治觯鳛檫M(jìn)一確診試驗(yàn)。

1.4 初篩陽(yáng)性與基因確診

12 409 例新生兒經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查初篩陽(yáng)性IMD 352例（2.83%），按陽(yáng)江市新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范要求，對(duì)所有初篩陽(yáng)性患兒召回重新采血復(fù)查一次和進(jìn)行尿有機(jī)酸分析，對(duì)復(fù)查陽(yáng)性和尿有機(jī)酸異常的患兒進(jìn)行基因分析，最終確診3例（0.02%）。①高苯丙氨酸血癥（HPA）、基因結(jié)果：CDS12；Het錯(cuò)義突變。②原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）、基因結(jié)果：c.760C＞(p.R254X)。③3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（MCCD）、基因結(jié)果：chr3 exon12 c.1 331 g＞A(p.r444h)雜合突變。

1.5 治療與隨訪

對(duì)于確診的3例IMD患兒分別為高苯丙氨酸血癥（HPA）1例、原發(fā)性肉堿缺乏癥（PCD）1例、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥(MCCD)1例。HPA確診后立即給予低血苯丙氨酸（Phe）飲食，選擇低Phe或無(wú)Phe的奶粉、面、米等，確保蛋白質(zhì)、熱量和一定數(shù)量Phe攝入，隨著患兒年齡不斷增長(zhǎng)，對(duì)食譜及時(shí)調(diào)整，注意補(bǔ)充微量元素和維生素，定期監(jiān)測(cè)血Phe濃度。PCD確診后按照血液游離肉堿(C0)濃度給予左卡尼（國(guó)藥準(zhǔn)字H20000522）治療，50～200 mg/（kg·d），分次服用，待C0水平恢復(fù)正常后維持劑量（終身服藥），避免饑餓。MCCD確診后立即給予生物素（國(guó)藥準(zhǔn)字H20031188）10～40 mg/d治療，急性期輔助低蛋白質(zhì)、肉堿攝入等治療。跟蹤隨訪1年，定期影像學(xué)檢查、體格發(fā)育檢查和心理發(fā)育檢查等，并密切觀察血液中氨基酸譜等濃度。

1.6觀察指標(biāo)

分析串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在新生兒IMD中篩查價(jià)值。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及百分比表示，組間差異比較以χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

12 409 例新生兒經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查出高度疑似IMD 352例（2.83%），其中確診3例（0.02%）。3例確診IMD患兒均為足月分娩兒，其中HPA 1例、PCD 1例、MCCD 1例。隨訪1年，3例患兒均因及時(shí)確診病情，及時(shí)實(shí)施相應(yīng)的治療措施干預(yù)，無(wú)明顯癥狀。HPA、PCD、MCCD患兒因及時(shí)治療，體格、智力發(fā)育正常，因PCD是由SLC22A5基因突變?cè)斐扇鈮A轉(zhuǎn)運(yùn)體（OCTN2）蛋白功能缺陷所致，治療的關(guān)鍵在于補(bǔ)充C0，而MCCD可以參與生物素代酶缺乏和參與生物素代謝的全羧化酶合成酶缺乏所致，表現(xiàn)為難治性皮膚損害、神經(jīng)系統(tǒng)損害和代謝性中毒，治療的關(guān)鍵在于補(bǔ)充機(jī)體生物素水平。 不同季節(jié)、性別、出生體質(zhì)量、孕周確診IMD率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同季節(jié)、性別、出生體重、孕周確診IMD情況對(duì)比[n(%)]

3 討論

IMD是一類(lèi)主要由氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸代謝異常所致的代謝功能缺陷的遺傳病，能誘發(fā)機(jī)體重要生物物質(zhì)缺失、代謝物沉積等，導(dǎo)致患者出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常、代謝性酸中毒、酮癥等多種臨床癥狀，多見(jiàn)于兒童時(shí)期，病情呈緩慢進(jìn)行性進(jìn)展[8-10]。IMD可影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育，其中經(jīng)典的IMD苯丙酮尿癥出生時(shí)一般無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，但出生3個(gè)月后患兒會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育、智能落后，隨著年齡不斷增長(zhǎng)而逐漸加重，病情嚴(yán)重時(shí)患兒的智商不足50[11-13]。早期準(zhǔn)確篩查IMD，明確診斷，實(shí)施有效治療措施干預(yù)，是規(guī)避小兒發(fā)育不可逆風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。因IMD病種較多，常規(guī)使用細(xì)菌抑制法、熒光法等檢查一次實(shí)驗(yàn)僅能檢測(cè)出一種疾病，工作量大，篩查效率較低，無(wú)法滿(mǎn)足臨床需求[14-16]。

串聯(lián)質(zhì)譜分析中數(shù)據(jù)的采集是通過(guò)中性粒子丟失、母離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)3種模式來(lái)完成，基本原理是將分析物電離成質(zhì)荷比不同的帶電離子，將電磁學(xué)原理分離離子，并測(cè)定離子峰值強(qiáng)度，經(jīng)與內(nèi)標(biāo)液隊(duì)徽，定量分析標(biāo)本中的物質(zhì)濃度，檢測(cè)水平能達(dá)到pg級(jí)，可在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)一種檢測(cè)篩查出多種疾病，具有檢測(cè)效率高、操作簡(jiǎn)單方便、所需樣本量微小、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)[17-18]。該研究中，12 409例新生兒經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)篩查出高度疑似IMD 352例（2.83%），其中確診3例（0.02%），均為足月分娩兒，其中HPA 1例、PCD 1例、MCCD 1例。隨訪1年，3例患兒均因及時(shí)確診病情，及時(shí)實(shí)施相應(yīng)的治療措施干預(yù)，無(wú)明顯癥狀，不同季節(jié)、性別、出生體質(zhì)量、孕周確診IMD率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能有效篩查出新生兒IMD，指導(dǎo)臨床盡早治療。因IMD是由機(jī)體部分受體或膜、酶等生物合成過(guò)程中出現(xiàn)遺傳缺陷，造成體液、細(xì)胞中的毒性中間代謝產(chǎn)物大量聚集或必須代謝產(chǎn)物缺乏，引起氨基酸、乙酰肉堿等代謝產(chǎn)物增高。串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)通過(guò)干血濾紙片分析氨基酸、乙酰肉堿等，能篩查出脂肪酸代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂、有機(jī)酸代謝紊亂等在內(nèi)的共40余種IMD，臨床應(yīng)用價(jià)值較高[19-21]。但串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)受到新生兒出生體質(zhì)量、胎齡、采血時(shí)間等影響，存在一定的假陽(yáng)性率，儀器價(jià)格昂貴且保養(yǎng)、操作費(fèi)用相對(duì)較高，在基層醫(yī)院推廣受到一定的限制。周偉等[22]對(duì)徐州地區(qū)新生兒遺傳代謝疾病篩查顯示，165 262例新生兒中篩查可疑陽(yáng)性例數(shù)為3 344例，召回率為91.23%，其中確診IMD 94例（0.06%），包含12例原發(fā)性肉堿吸收障礙，5例母源性肉堿吸收障礙，12例甲基丙二酸血癥，1例戊二酸血癥Ⅰ型，2例戊二酸血癥Ⅱ型，52例苯丙酮尿癥，其他11例。該研究中，陽(yáng)江地區(qū)的IMD發(fā)病率與上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果相比相對(duì)較低，這可能與陽(yáng)江地區(qū)區(qū)域性有關(guān)（陽(yáng)江是廣東省經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，多年來(lái)外來(lái)人口少，該研究的12 409例新生兒父母雙親絕大多數(shù)都是當(dāng)?shù)鼐用瘢?9間分娩醫(yī)院覆蓋了陽(yáng)江市各個(gè)區(qū)、縣）。該研究因研究時(shí)間和精力有限，結(jié)果仍存在一定的不足之處，如未與他人研究結(jié)果相對(duì)比、隨訪時(shí)間較短等，后期仍需加大樣本量深入研究。

綜上所述，早期行串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)能有效篩查出IMD，指導(dǎo)臨床治療，對(duì)于提高新生兒生存質(zhì)量具有重大意義。