卵巢上皮性癌組織中長鏈非編碼RNA PURPL的表達及其意義*

何婷婷 張瑞濤 史惠蓉 曹媛 馮巍 王文文 張微微

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）可在基因轉錄和轉錄后水平發揮重要的調節功能，參與細胞增殖、凋亡、轉移、代謝、維持基因穩定性和化療耐藥等多種生理病理過程[1]，lncRNAs 與惡性腫瘤的發病密切相關。研究顯示，在胃癌組織中可檢測到長鏈非編碼RNA PURPL（p53 upregulated regulator of p53 levels）的表達水平明顯高于癌旁組織，且與腫瘤的直徑、臨床分期密切相關，提示PURPL 與胃癌患者預后不良相關[2]。本課題組前期研究了微小RNA-338-3p（microRNA-338-3p，miRNA-338-3p）及其靶基因MET 轉錄調節因子MACC1 表達異常與卵巢癌發生發展的關系[3]，ENCORI 數據庫檢索提示PURPL 可靶向調節miRNA-338-3p。目前，在卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）組織中的PURPL 表達鮮有報道，本研究旨在初步分析PURPL 在卵巢癌組織中的表達情況及其與卵巢癌患者預后的關系，為進一步研究PURPL 參與卵巢癌發病的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2012年10月至20215年10月鄭州大學第一附屬醫院105 例患者的臨床病理資料，其中包括正常卵巢組織20 例、良性卵巢上皮性腫瘤組織20 例、EOC 組織65 例，年齡分別為（45～62）歲、（25～48）歲、（28～76）歲，中位年齡分別為51、39、50 歲。所有患者病例資料詳見本課題組前期報道[4]。本研究經本院道德倫理委員會批準，并獲得患者或家屬知情同意。

1.1.2 主要試劑 組織RNA 提取試劑Trizol、cDNA-反轉錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒分別購自美國Invitrogen、加拿大Fermentas、大連Takara 公司。

1.2 方法

1.2.1 醫學數據庫檢索 選用開放醫學數據庫lnc-RNASNP2 和GEPIA 檢索PURPL 在人類惡性腫瘤組織和配對的正常組織中的表達差異，使用Kaplan-Meier Plotter 數據庫檢索PURPL 與EOC 預后的關系。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測 組織總RNA 使用Trizol 提取，經純化、定量、反轉錄，進而參照SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒說明書構建反應體系進行PCR 反應，以β-actin 作為內參。PCR 所用引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列為PURPL 正義：ACACGGGGCTTGAGAAATGA，反義：TCAATC TCCAAAATAGCCGGA；β-actin 正義：CATGTACGT TGCTATCCAGGC，反義：CTCCTTAATGTCACGC ACGAT。PCR 反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，共40 個循環。每次PCR實驗重復3 次，相對表達量采用2-ΔΔCt計算。ΔΔCt=實驗樣本ΔCt-校準樣本ΔCt。

1.2.3 隨訪 隨訪時間為16～61 個月，中位隨訪時間為38 個月，隨訪結束時65 例EOC 患者中46 例生存，19 例死亡。研究的終點事件分別為患者死亡或無復發生存，如患者在隨訪結束時未死亡或未復發則定義為截尾事件，統計時予以刪失。死亡時間定義為隨訪開始至患者因腫瘤原因導致死亡的時間，無復發生存時間定義為隨訪開始至患者因腫瘤原因導致復發的時間。隨訪截止至2018年2月。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析。采用Graph Pad Prism 7 軟件繪圖。相對表達量采用xˉ±s表示，表達差異性檢驗采用單因素ANOVA 分析和LSD-t檢驗，相關性分析采用χ2檢驗或Fisher 精確概率法，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線分析總生存率和無復發生存期。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 數據庫檢索

經lncRNASNP2 和GEPIA 數據庫檢索，與配對的正常組織相比，在多種人類惡性腫瘤組織中PURPL 高表達，其中包括EOC（圖1）。經Kaplan-Meier Plotter 數據庫分析，PURPL 高表達與EOC 患者的無復發生存期（recurrence-free survival，RFS）和總生存期（overall survival，OS）縮短相關（圖2）。

圖1 人類不同惡性腫瘤癌組織及其配對的正常組織中的PURPL 表達

圖2 PURPL 表達與EOC 患者RFS 和OS 的關系

2.2 不同卵巢組織中PURPL 的表達

實時熒光定量PCR 檢測結果顯示，在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、早期EOC 組織和晚期EOC組織中PURPL 的相對表達量分別為0.029±0.001、0.135±0.001、0.488±0.006 和0.530±0.004。與正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織相比，EOC 組織中PURPL 的表達明顯升高（F=4 836.000，P＜0.000 1），且晚期EOC 組織中PURPL 的相對表達量（0.530±0.004）明顯高于早期EOC 組織的（0.488±0.006），兩者比較具有顯著性差異（t=4.918，P＜0.000 1）。

2.3 EOC 組織中PURPL 的表達與臨床病理指標的關系

65 例EOC 組織標本中PURPL 的中位表達水平為0.525±0.006，設定PURPL 表達水平≥中位數為高表達、PURPL 表達水平＜中位數為低表達。分析各臨床病理指標與PURPL 表達的關系顯示，臨床分期越晚、有淋巴結轉移的EOC 組織中的PURPL 表達較高（表1）。

表1 EOC 組織中的PURPL 表達與臨床病理指標的關系

2.4 Kaplan-Meier 生存分析

在65 例EOC 患者中，PURPL 高表達患者的OS和RFS 均短于PURPL 低表達患者（χ2=4.654，P=0.031 和χ2=5.878，P=0.015，圖3）。

圖3 EOC 組織中的PURPL 表達與患者生存率的關系

3 討論

近年來，隨著手術水平的不斷提高、新型化療藥物的開發，EOC 臨床治療效果已經有了長足提高，尤其是靶向治療和免疫治療的出現，為復發和耐藥EOC 患者的治療提供了新的手段。但EOC 仍是死亡率最高的婦科惡性腫瘤[5]，是威脅女性生殖健康的重要疾病之一，其發生發展的分子機制目前尚不十分清楚。

人類基因組的轉錄產物近98% 是非編碼RNA，其中lncRNAs 是指長度＞200 個核苷酸片段的非編碼RNA，其主要功能之一就是作為競爭性內源性RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）靶向結合微小RNA（microRNAs，miRNAs），即作為miRNA 海綿，避免其下游靶基因的降解和功能抑制[6-7]。研究證實，lncRNAs 與惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移關系密切，如結腸癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌、EOC 等，可作為評估上述惡性腫瘤預后的分子標記物和潛在的臨床治療靶點[8-13]。

PURPL 又稱LINC01021，主要通過破壞p53 穩定性、降低p53 水平，進而影響細胞周期進展和細胞生長，利用CRISPR/Cas9 技術抑制PURPL 表達，可使結腸癌細胞中抑癌基因p53 水平增加、細胞周期G1 期阻滯、細胞生長受限、動物體內移植瘤生長抑制[14]。另有研究顯示，與癌旁的正常組織相比，肝癌組織中的PURPL 高表達，其表達水平與腫瘤分期和腫瘤大小呈正相關、與p53 mRNA 水平呈負相關，抑制細胞中的PURPL 表達可使腫瘤細胞生長受限、細胞周期進程阻滯和凋亡增加[15]。目前，PURPL 與EOC發生發展的關系尚不清楚。

由于PURPL 與人類惡性腫瘤關系的研究報道較少，本課題組首先采用開放醫學數據庫進行檢索，初步分析PURPL 在不同人類惡性腫瘤組織及配對的正常組織中的表達情況，以初步明確PURPL 與惡性腫瘤發生發展的關系。經對多個醫學數據庫檢索，lnc-RNASNP2 和GEPIA 數據庫提示，PURPL 在包括EOC 組織在內的多種人類惡性腫瘤組織中的表達，均明顯高于配對的正常組織。進一步對Kaplan-Meier Plotter 數據庫檢索顯示，PURPL 高表達與EOC 患者RFS 和OS 縮短相關。為了驗證上述數據庫信息，本研究檢測正常卵巢組織、良性上皮性卵巢腫瘤組織、早期EOC 組織和晚期EOC 組織中的PURPL 表達結果顯示，與正常卵巢組織和良性上皮性卵巢腫瘤組織相比，EOC 組織中PURPL 表達明顯升高，提示PURPL 異常高表達可能參與了EOC 的發生和進展。上述研究結論與既往胃癌、結腸癌、肝癌等有關PURPL 的研究報道結論一致[2,14-15]，提示PURPL 異常表達參與調控多種人類惡性腫瘤的發生發展。本研究進一步分析顯示，晚期EOC 組織中的PURPL 相對表達量明顯高于早期EOC 組織；臨床分期越晚、有淋巴結轉移的EOC 組織中的PURPL 表達越高；PURPL表達越高，患者的OS 和RFS 明顯縮短。

綜上所述，本研究通過數據庫檢索和組織樣本檢測，證實EOC 組織中存在PURPL 高表達，且與患者的預后不良相關，可作為卵巢癌預后監測的潛在標記物。并為深入研究EOC 細胞中的PURPL 靶向和調控下游miRNAs 及相關基因的分子機制提供了實驗基礎，在此基礎上進一步研究血清PURPL 與CA125表達水平與EOC 治療和預后監測的關系，有助于探尋新的EOC 治療和預后監測的分子標記物。