浮水植物-底泥-微生物系統對富營養化水體氮的凈化作用

鄔淑婷,周之棟,華建峰,殷云龍,薛建輝

〔江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園),江蘇 南京 210014〕

湖泊水體富營養化已成為水環境污染的一個重要問題，其主要原因是城市生活污水，造紙、煉鋼等工業廢水以及農藥和化肥等地表污染物，包含了大量有機物和無機營養物質[1]。這些物質進入水體后，為藻類及浮游生物提供了充足的生長條件，使其迅速繁殖，造成水體溶解氧不斷下降，導致水質不斷惡化[2-3]。根據《第二次全國污染源普查公報》，2017年度農業廢水、生活廢水和工業廢水中總氮(TN)含量占比分別為46.61%、48.26%和5.13%，總磷(TP)含量分別為67.24%、30.26%和2.51%[4]。構建人工濕地以進行富營養化水體的生態修復已成為熱點研究。水生植物作為濕地生態系統的重要組成部分，是調節水質、減緩水體富營養化的重要載體[5-7]。水生植物不僅能夠通過吸收環境中N、P等營養物質，轉化為自身可利用的物質；也可以通過向外界排放化感物質，控制藻類的繁殖代謝[8]；還能夠為微生物提供適宜的生活環境。微生物的存在對水生態環境的修復至關重要[9-10]，其主要通過硝化-反硝化作用對人工濕地產生脫氮效應[11-14]。同樣，底泥能夠通過截留與沉降作用，去除富營養水體中的N、P等[15]。

根據水生植物的生活方式，一般將其分為挺水植物、浮水植物和沉水植物。對蘆葦(Hragmitescommunis)、黃花鳶尾(Iriswilsonii)及菖蒲(Acoruscalamus)等挺水植物的研究表明，其對試驗水體氨氮(NH4+-N)的去除率均在90%以上，對TN的去除率也不低于75%，其中黃花鳶尾對TN的去除效果較好[12]。劉會等[16]對沉水植物的研究發現，竹葉眼子菜(Potamogetonintortifolius)、黑藻(Hydrillaverticillata)及苦藻(Vallisnerianatans)對水體TN的去除效果較好。與挺水和沉水植物相比，浮水植物水深適應范圍廣，繁殖迅速，去除N、P能力強，又能遮蔽射入水中的陽光，抑制水體中藻類的生長，更便于種植、收割和日常管理，一直是人工濕地構建過程中重要的植物類型[17]。槐葉萍(Salvinianatans)及浮水蓮(Eichhorniacrassipes)對TN的去除效果較好，對提高水體透明度效果也較佳[18]。除了水生植物直接吸收營養物質外，有研究發現，復合微生物對豬場糞污水NH4+-N有明顯的削減效果，去除率可達60%以上[19]。在好氧微生物的脫氮作用下，底泥釋放的總氮和硝氮的去除率分別高達75.87%和79.96%，底泥內源氮污染得到有效的控制[20]。此外，添加微生物菌劑的生物強化系統對模擬城市污水中NH4+-N和TN的去除率分別提高了56.06%和70.56%，表明微生物作用能夠顯著改善模擬城市污水系統的運行效果和穩定性[21]。

水生植物具有根系量大且發達的特征，能夠與微生物進行協同作用，實現濕地生態系統的高效凈化[22]。有研究表明，水生植物通過根系釋放氧氣與分泌物增加環境體系內的溶解氧與有機質，由于能量及養分源充足，微環境適宜微生物的生長，進而提高了底泥中微生物活性與新陳代謝，促進了富營養化水體C、N和P的循環[23-24]。對杭州西溪濕地挺水、浮水、沉水等濕生植物的研究發現，其底泥具有很高的細菌多樣性，且最優勢的菌群均為變形菌門(Proteobacteria)，在這些類群中具有大量與N、S、P等代謝相關的菌群，對濕地底泥的元素循環有重要作用[25]。此外，人工濕地種植的蘆葦與香蒲(Typhaorientalis)的根際細菌群落結構有一定的差別，表現為蘆葦根際細菌群落豐富度及多樣性均高于香蒲根際，優勢細菌種群大多以變形菌門、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)及厚壁菌門(Firmicutes)為主[26]。

構建人工濕地，通過植物-底泥-微生物之間的協同作用[11]，不僅能修復生態環境[27]，也能達到經濟高效的目的[28-29]。然而，現有大部分報道集中于研究單獨栽種植物或是添加微生物對富營養化水體的凈化作用，或者植物對底泥微生物群落結構的影響，從而間接表明微生物在水體凈化中的重要作用，但鮮有將植物-底泥-微生物作為一個系統來研究各途徑在富營養化水體凈化中發揮的作用。因浮水植物具有水深適應范圍廣、吸收能力突出且易于收割等特性，以水龍(Ludwigiaadscendens)等華東地區常見的浮水植物為對象，采集池塘底泥，通過植物種植試驗和底泥滅菌試驗，研究植物-底泥-微生物系統中不同途徑對不同富營養化程度水體N的凈化作用，為濕地生態系統的生態修復提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇華東地區水域常見的水龍、荇菜(Nymphoidespeltata)、睡蓮以及水金英(Hydrocleysnymphoides)4種浮水植物作為研究對象。所選植物均采購自宜興市龍鼎實業有限公司種植基地，且生長狀況良好、形狀統一，試驗前在自來水中統一馴化培養7 d。

1.2 試驗設計

試驗在江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園)試驗溫室內(32°03′ N，118°49′ E)進行。預先向花盆(內徑35 cm，高45 cm)內填充10 kg取自南京中山植物園池塘的底泥，底泥理化性質：w(TN)為2.371 mg·g-1，w〔有機碳(IN)〕為31.101 mg·g-1，w(有機質)為53.618 mg·g-1，w(NH4+-N)為0.031 mg·g-1，w(無機氮)為0.058 mg·g-1。

補充35 L河水(包括底泥，水深約40 cm)并充分混合靜置后，加入由硝酸銨(NH4NO3)配制成的3種不同TN質量濃度(2、10、20 mg·L-1)的富營養化水體。然后，將生長狀態良好、外形一致(植株大小、形狀、葉數、葉色等)、鮮重接近的植株用自來水洗凈后種植在花盆內。同時，設置不種植任何植物的花盆作為空白對照(CK)。每個處理各設4個重復，隨機區組排列于溫室內。試驗周期為2019年6月6日—2019年7月16日。試驗期間，向各處理花盆內定期加入新鮮自來水補充水分蒸發流失，以保持水位一致。

為了研究微生物在富營養化水體凈化中的作用，取與上述試驗相同的原始池塘底泥，部分經2次高壓滅菌(121 ℃，1 h)以去除體系內微生物，另一部分則未滅菌。分別向花盆(內徑15 cm，高20 cm)內填充1 kg原始底泥(US)或滅菌底泥(S)，分別補充2 L自來水或滅菌水(包括底泥，水深約15 cm)并充分混合靜置后，加入由NH4NO3配制成的3個不同TN質量濃度(3、10、15 mg·L-1)的富營養化水體。每個處理設置3個重復，隨機區組排列于溫室內。試驗周期為2019年9月6日—2019年9月16日。試驗期間，向各處理花盆內分別定期加入新鮮自來水或無菌水，補充蒸發流失以保持水位一致。

1.3 樣品采集

試驗開始后，在第1、10、20、30、40天分別采集10 mL水樣測定TN、NH4+-N、NO3--N濃度。試驗前后，取花盆內底泥并測定其干樣TN及鮮樣IN含量。植物收獲后，將根與莖葉分開，用蒸餾水洗凈后，烘箱內烘干(80 ℃)24 h，測定干重。將植物及風干底泥樣品采用研磨機粉碎，植物過0.25 mm孔徑篩，底泥過0.15 mm孔徑篩后密封于自封袋，用于植物及底泥N含量的測定。同時取根際底泥，用于測定微生物的相關指標。

底泥滅菌試驗開始后，在第1、3、5、7、9、11天分別采集10 mL水樣測定TN、NH4+-N、NO3--N含量。試驗前后，取花盆內底泥并測定其鮮樣IN含量。

1.4 樣品測定

水體TN、NH4+-N、NO3--N及NO2--N濃度均使用流動分析儀(De Breda,荷蘭)測定[30]。植物樣品中的N含量采用濃H2SO4-H2O2消解，凱氏定氮法測定[31]。同時選用土壤標準樣品(GSS-3)及植物標準樣品(GBW07603)控制分析的準確性。底泥IN含量通過Bremner氯化鉀法提取后，使用流動分析儀測定。

水體N去除率和底泥N去除率(積累率)[32]的計算方法為

ηw=(C0-Ci)/C0×100%，

(1)

ηs=(Ci-C0)/C0×100%。

(2)

式(1)～(2)中，ηw為富營養水體中N的去除率，%；C0為測定指標的起始濃度，mg·L-1；Ci為試驗結束時測定指標的濃度，mg·L-1；ηs為底泥TN和IN的積累率(正值)或去除率(負值)，%。

細菌DNA經抽提、濃度和純度檢測后，對其16S rRNA V3-V4區進行PCR擴增。選用引物為515F(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACNVGG GTWTCTAAT-3′)[10]。在廣東美格基因科技有限公司進行Illumina HiSeq高通量測序。測序數據經過質量篩選，利用Usearch軟件以97%相似性水平進行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)劃分，對比Silva數據庫進行分類學分析。采用R語言計算Chao、Simpson和Shannon-Wiener多樣性指數。

1.5 數據處理

統計分析采用SPSS 25.0軟件處理，作圖采用Origin 9.1及Excel 2016軟件，部分參數比較差異進行單因素方差(One-way ANOVA)及單樣本的T檢驗(t-test)分析,多重比較選用Duncan新復極差方法。

2 結果與分析

2.1 水體N濃度的變化

40 d的生長期內，低N水體中，水金英、荇菜和睡蓮處理組TN去除率分別為82.70%、64.25%和65.98%；水龍處理組與對照組對TN的去除效果較差，且顯著低于水金英組(P<0.05)。中N水體中，荇菜處理組TN去除率最高(92.43%)，且顯著高于對照(P<0.05)；其他植物處理組(除睡蓮組)TN去除率均達90%以上，但與對照組相比并無顯著性差異。在高N水體中，對照組和處理組TN去除率均達94%，尤其是荇菜處理組，去除率為96.18%，顯著高于其他處理組(P<0.05)。由此可知，在低N水體中水金英去除效果最佳；中、高N水體中去除率為荇菜>水金英>水龍>睡蓮。總體上，高N水體中TN的去除率高于其他富營養化水體(圖1)。

試驗前10 d內，各處理組水體ρ(NH4+-N)迅速下降，其中低N水體以荇菜、睡蓮處理組的去除率最高，分別達92.78%和90.48%；而中、高N水體中，植物處理組在前10 d內去除率均高于96%，對照組去除率也高達94.15%。同樣，各處理組水體ρ(NO3--N)大幅下降。試驗結束時，所有處理組NO3--N去除率均達98.28%以上，ρ均低于0.35 mg·L-1，且各植物處理組(除睡蓮組外)之間無顯著差異。

2.2 浮水植物對N的積累

隨著N濃度的升高，水龍各部位生物量逐漸減少，而荇菜莖葉生物量呈增加的趨勢；水金英根生物量在中N水體中顯著低于高N水體(P<0.05)；同一N濃度系統中，睡蓮組植株生物量最高(除中N荇菜組外)，且在低、高N水體中顯著高于中N水體(P<0.05)(表1)。

表1 不同N濃度下植株生物量與氮含量Table 1 Plant biomass and N contents of 4 plants under different N concentrations

植物莖葉的w(N)為23.33～59.62 mg·g-1，高于根部(10.19～16.81 mg·g-1)。相比于中、高N水體，低N水體中水龍處理組植株的N積累量更多。睡蓮處理組更適應在高N環境中生長，不僅生物量顯著高于其他植物(P<0.05)，且其對N的積累率也最高。

2.3 底泥N含量的變化

試驗結束時，底泥w(TN)為2.02～2.75 mg·g-1，且在不同N水體中及處理之間無顯著差異。對照組在任何N水體中均表現出對IN的積累效應，而植物組低N及中N水體中底泥IN均有所去除，低N水體中去除效果依次為荇菜>睡蓮>水龍>水金英，中N水體中荇菜>睡蓮>水金英>水龍；但高N水體中IN呈現出積累趨勢(表2)。

表2 不同處理條件下底泥N含量Table 2 Contents of N in sediments of different systems

2.4 微生物對N去除的影響

微生物處理下，3種N水體中的TN濃度隨著時間的推移而降低，而滅菌組水體TN濃度在第1天有所升高，試驗末期均穩定在10～12 mg·L-1。除中N水體的第5和7天外，滅菌組3種N水體TN濃度均顯著高于有菌組(P<0.05，圖2)。試驗初期，滅菌組3種N水體NO2--N和NO3--N濃度高于有菌組，但隨著時間的推移，其濃度與有菌組趨于一致，均低于0.6 mg·L-1。有菌組水體NH4+-N濃度自試驗開始一直呈減少趨勢，并在7 d后基本被去除；而滅菌組水體NH4+-N濃度在整個試驗周期內均顯著高于有菌組(P<0.05)，最終ρ分別為7.84、9.37和9.73 mg·L-1。

滅菌組底泥IN含量顯著高于有菌組(P<0.05)，為有菌組的5～8倍，且不同N水體之間基本無差異。

2.5 植物根際微生物的變化

低N水體中各植物組Chao1指數大于對照組(睡蓮組除外)，且水龍>水金英>荇菜；中N水體荇菜組和睡蓮組大于對照組，而水龍組和水金英組則低于對照組。高N水體中，所有植物組均小于對照組。Shannon指數在7.15～7.35之間，Simpson指數在0.99以上浮動，各水體之間并沒有顯著差異(表3)。

表3 植物根際底泥細菌α多樣性指數Table 3 α diversity index of bacteria in rhizosphere soil

各水體中優勢菌均為變形菌門，平均相對豐度為41.28%，其次為綠彎菌門(Chloroflexi,17.56%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，9.38%)、綠菌門(Chlorobi，4.76%)、疣微菌門(Verrucomicrobia，4.19%)、酸桿菌門(Acidobacteria,3.93%)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae，2.63%)(圖3)。低N濃度處理下，所有植物組變形菌門和硝化螺旋菌門相對豐度均高于對照組。此外，除了荇菜在中、高N濃度處理以及睡蓮在高N濃度處理外，其余各植物組硝化螺旋菌門均高于對照組。低、中N濃度處理下荇菜組及高N濃度處理下睡蓮組中，綠彎菌門相對豐度均高于對照組，但無顯著性差異(圖3)。

在屬水平上，所測得的OTUs共552個門類。平均相對豐度最高的為硫桿狀菌屬(Thiobacillus，12.59%)，其次為Sideroxydans(9.52%)、Ignavibacterium(6.40%)；平均相對豐度大于3%的屬還有脫硫桿菌屬(Desulfatiglans，3.86%)、螺桿菌屬(Sulfuricurvum，3.49%)、厭氧繩菌屬(Anaerolinea，3.45%)、Ferritrophicum(4.03%)、螺旋體屬(Spirochaeta，2.73%)和互營菌屬(Syntrophus，3.11%)。但各處理之間微生物群落結構差異并不顯著(圖4)。

3 討論

以往大量研究將植物在不添加底泥[33-35]的環境下進行培養，其對水體N的去除效果顯著優于對照組。筆者添加池塘底泥后發現，對照組和植物組均具有較高的N去除率，而且大部分情況下兩者無顯著差異。40 d后，中、高N水體中TN去除率均高于87%，此外NH4+-N和NO3--N的去除率大部分也超過90%，高于大多數人工配置富營養化水體的模擬試驗[6,36]。

與劉利華等[37]的研究結果類似，隨著水體N濃度的升高，水體N去除率也隨之增加。在水體N濃度水平較低的條件下，N是植物生長的限制因子，而隨著水體N濃度的增加，植物生長更快，吸收利用的N越多，對水體N的去除率也就越高[38]。在不同N濃度水體中，同一植物的最終生物量基本(除水龍及睡蓮外)無明顯差異。但整體而言，睡蓮、荇菜、水金英對營養的轉化吸收高于水龍，對N的積累也明顯較高。可見，生物量是決定體系凈化能力的一個重要因素，植物凈增長越高，其帶走體系內的富營養物質就越多[33]。

此外，對照組雖然沒有因植物對N的吸收積累而產生N的消減作用，但其水體N的去除效率仍然較高。通過對底泥IN的分析發現，低N和中N水體中，對照組底泥IN含量顯著高于植物處理組。可見，低N和中N水體中部分N僅僅因為沉降作用留在底泥中。李勝男等[39]通過對不同濕地植物N的研究發現，水體中TN濃度不僅依賴于植物積累，也與底泥的作用有關，因為整個系統內，底泥與水體一直在進行N的循環交換。周林飛等[40]通過是否添加底泥對6種植物水質理化性質進行研究，發現底泥對水體N有一定的吸附作用。高N水體中植物組底泥IN含量低于對照組，但是兩者之間沒有顯著差異。整個系統的N濃度超出了植物對N的吸收范圍，呈現出底泥IN積累的趨勢。可見，植物對IN的吸收也有一定的限制。

濕地生態系統中的N除了通過植物直接吸收和沉降去除外[6,10,41-44]，微生物在其消減過程中也發揮著重要作用。大量研究表明，微生物的生命活動可以將水體N通過其自身新陳代謝(包括硝化與反硝化以及氨的揮發等)以及高降解轉化作用去除[25]。水生植物的種植加速了水體-底泥-植物系統中底泥N的釋放，為底泥微生物提供了充足的N源，顯著提升了其活性及N循環菌的數量，促進了系統內的N循環[41]。劉丹丹等[42]通過模擬生態柱種植伊樂藻，同時添加固定化N循環菌系統，認為沉水植物對微生物反硝化過程的促進大于其本身對N的吸收作用。而且不同植物區的底泥微生物群落在豐富度和多樣性上均有所差異，而不同采樣點的相同植物類型中，微生物群落組成較為相似，表明種植植物及植物種類對微生物群落結構有顯著影響，且N濃度對微生物群落結構有一定的影響[10]。通過對長江口崇明東灘濕地微生物群落結構的研究發現，就細菌16S rRNA 基因拷貝數而言，植被區底泥遠遠高于光灘區表層，且門水平中占比較高的綠彎菌門對底泥TN、NH4+-N和NO3--N較為敏感，呈顯著正相關[45]。但是筆者研究表明，植物處理的根系微生物群落并未發生顯著變化，這可能是因為試驗周期較短以及底泥自身營養物質較為豐富，植物尚無法通過改變生境的營養環境來影響其菌落組成結構的多樣性[45]。

滅菌組水體TN和底泥IN的去除效果顯著弱于有菌組，該現象解釋了對照組無植物種植，但也能在短時間內對各個形態的N有較高的去除率。滅菌組水體TN和NH4+-N濃度升高則可能是因為高溫滅菌條件下，土壤理化結構被破壞，土壤有機質被分解，導致土壤中部分TN和NH4+-N進入至水體[46]。可見，底泥原有的微生物群落足以在富營養化水體凈化中發揮巨大作用。優勢菌種以變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門為主，與已有研究相一致[10,47]。其中，變形菌門包括許多固N細菌，對N的轉化及植物吸收有促進作用[26]。Sulfuricurvum屬、Ferritrophicum屬、Sulfuricella屬、Thiobacillus屬與Sulfuricurvum屬歸屬于變形菌門，包括氨氧化菌、亞硝酸氧化菌以及反硝化菌等[48]。其中，Ferritrophicum屬為自養反硝化菌[49]。Thiobacillus屬是專性化能自養型硫氧化菌，能將單質硫、硫化物等底物氧化為硫酸鹽，同時也是典型的硝酸鹽依賴型亞鐵氧化菌，氧化Fe(Ⅱ)的同時，利用NO3-作為電子受體并耦合還原為NH4+[50]，其大部分菌群可在厭氧條件下進行自養反硝化作用[45]。Thiobacillus屬及Sulfuricurvum屬相對豐度較高，與對照組及試驗組水體前期NO3--N迅速下降，且最終去除率絕大多數高達90%以上的情況相關性較高。總體占比第2的綠彎菌門是一類以CO2為C源，通過光合作用產生能量的細菌。綠彎菌門的這種光合特性可使其在 SOC含量較低的底泥中具有競爭優勢[51-52]，同時對枯枝腐葉的C循環分解具有潛在作用[41]。此外，硝化螺旋菌門占比較高，其中的硝化螺旋菌屬包含了大量的氨氧化菌[36]，可以將環境中的NO2--N氧化成NO3--N，在水體中參與N循環，對于促進NH4+-N、NO3--N的轉化及水生植物的生長具有重要意義[25]。

有研究表明，當水體遭到新的污染時，有機N被微生物氧化分解為NH4+-N，而NH4+-N去除周期較短，一般在7 d左右即可達到穩定，所以這期間TN濃度迅速下降[53]。同時，因底泥中一般帶負電荷，能夠吸引帶正電的NH4+-N，其能夠通過物理吸附和絮凝沉淀等作用使水體中的N沉降，由此使水體中NH4+-N濃度降低[54]。而在移栽初期，植物為維持自身生長需要，需要大量水分與養分，也導致試驗前10 d內NO3--N濃度的迅速下降[55]。當植物適應移栽環境后，其對營養的需求減少；且隨著植物體內各種元素的再分配，使得植物吸收水體N的速率減慢，導致水體TN、NH4+-N及NO3--N濃度降低速度趨于平緩[56]，而且微生物在富營養化水體N凈化中的作用遠大于植物。

4 結論

4種水生植物通過對N的吸收累積作用，在一定程度上降低了不同富營養化水體的NH4+-N、NO3--N及TN濃度，其中睡蓮、荇菜及水金英效果較好。此外，低N和中N濃度處理的N沉降現象，也使其表現出了較高的水體N去除效應。由于試驗周期較短(40 d)，種植水生植物并沒有顯著改變根際底泥微生物群落結構。但是，底泥滅菌試驗表明，微生物在富營養化水體凈化過程中發揮了至關重要的作用。該研究闡明了富營養化水體中N的去除路徑，為有效構建人工濕地，利用水生植物、底泥和微生物，高效、安全、持續地去除富營養化水體的N提供了科學依據。