藏藥薰倒牛正丁醇萃取部位降血糖作用研究

徐明麗，張艷霞，景 明，康萬榮，李存祥

1 甘肅衛(wèi)生職業(yè)學院,甘肅 蘭州730000；2 甘肅省高校中（藏）藥化學與質量研究省級重點實驗室/甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室培育基地；3 甘肅中醫(yī)藥大學

薰倒牛是薰倒牛科薰倒牛屬植物，主要分布于青藏高原、甘肅、新疆和四川等地，多見于海拔1000～3000 m 的河灘、路邊和山坡上［1］。據《晶珠本草》記載：“芒澗”，苦寒，治癰疽疔瘡，散腫止痛有特效［2］，民間藏醫(yī)慣用薰倒牛治療婦科炎癥［3］。現(xiàn)代研究證明薰倒牛科植物具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、降血糖等作用［4-6］，且薰倒牛對心血管系統(tǒng)功能有改善作用。本研究采用極性萃取法將薰倒牛乙醇提取物分離成不同極性部位，對正丁醇萃取部位的降血糖作用進行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼料SPF 級SD 大鼠60 只，動物生產許可證號：SCXK（甘）2011-0001，使用許可證號：SYXK（甘）2011-0001。雌雄各半，200～220 g，購自甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心，并飼養(yǎng)于其SPF 級實驗室。普通飼料及高脂飼料均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工制作。

1.2 藥品與試劑藏藥薰倒牛藥材于2016 年6月采自甘肅省永登縣武勝驛鎮(zhèn)，經甘肅農業(yè)大學農學院陳垣教授鑒定為薰倒牛科植物B.heterostemon 的全草，由甘肅省高校中（藏）藥化學與質量研究省級重點實驗室提取分離得到正丁醇部位，臨用前配成所需濃度；鹽酸二甲雙胍片（北京京豐制藥集團，批號：170625，規(guī)格：0.25 g×48片）；正丁醇、乙醇（天津市大茂化學試劑廠，均為分析純）；1% 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ，北京索萊寶科技有限公司，批號：615K0318，規(guī)格：5 g)注射液（用時以STZ 與0.1 mol/L PH 4.24 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制）；SOD、GSH-PX、MDA 檢測試劑盒（建成生物工程研究所，批號：20180205）；BS-101型血糖檢測試紙（杭州試劑電子有限公司，批號：2017322）。

1.3 儀器BG-102 型血糖儀（杭州試劑電子有限公司）；3K15 型低溫高速離心機（德國Sigma 實驗室離心機股份有限公司）；Epoch 型全波長酶標儀（Bio-Tek）；Practum 124-1CN 天平（多利斯科學儀器有限公司）；G50 組織研磨器（卡友迪生物科技有限公司）；YT-7F 型生物組織攤烤片機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司）；YB-6LF型冷凍包埋機（孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司）；Leica ASP 200 s 型全自動組織脫水機（德國徠卡公司）；奧林巴斯顯微鏡DP72 數(shù)碼成像系統(tǒng)（奧林巴斯）；LeicaRM2235 型輪轉切片機（德國徠卡公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模 選取體質量為200～220 g 的SPF級SD 大鼠60 只，隨機抽取10 只為正常對照組，正常喂養(yǎng)，其余50只用高脂飼料喂養(yǎng)30天后腹腔注射1%STZ 溶液（30 mg/kg），72 h 后取血測血糖，血糖值＞16.7 mmol/L為造模成功。

1.4.2 動物分組與給藥 將44 只造模成功大鼠隨機分成模型組8 只、陽性對照組（二甲雙胍第1周給藥濃度0.0045 g/mL，之后給藥濃度0.09 g/mL）9只，薰倒牛正丁醇萃取部位高（生藥量16.6 g/mL）、中（生藥量8.3 g/mL）、低（生藥量4.15g/mL）劑量組各9 只。各組給藥或灌胃生理鹽水，每日1 次，每次1 mL/100 g，連續(xù)30天。

1.4.3 觀察指標 1）一般體征：觀察實驗期間各組大鼠毛色光澤程度，反應靈敏程度，活動強度及飲食、飲水、體質量變化情況。2）血糖：大鼠尾部取血滴于血糖試紙上，血糖儀讀取血糖值。3）臟器指數(shù)：心臟采血處死大鼠，摘取心、肝、脾、腎及胸腺，精密稱重并計算臟器指數(shù)。4）血脂：最后1次給藥后大鼠禁食12 h，第2天心臟采血5 mL，離心半徑13.5 cm，3 000 r/min 離心10 min，取上清血用生化檢測儀測大鼠總膽固醇（cholesterol，CHOL）、甘油三酯(triglyceride，TG)。5）心臟采血2 mL，加入抗凝管中測γ-羥基丁酸(4-hydroxybutanoic acid,GHB)。6）肝臟總超氧化歧化酶（T-SOD）、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化氫酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測：取部分肝臟加入冰生理鹽水制作10% 胰腺組織勻漿，4℃下離心半徑13.5 cm，4000 r/min 離心10 min 后，分離上清液，用酶標儀檢測T-SOD、MDA、GSH-Px 含量。7）腎臟、胰腺病理學：取大鼠部分胰腺、腎臟，用4% 甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據，計量資料以xˉ±s表示，采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般體征實驗期間，正常組大鼠攝食、飲水量正常，反應靈敏，毛發(fā)光滑，精神狀態(tài)好。模型組毛發(fā)萎黃，反應遲鈍，多飲，多尿，體質量增長緩慢，各給藥組隨著給藥時間延長，一般活動狀態(tài)逐漸好轉，體質量緩慢增長。

2.2 臟器指數(shù)各組大鼠心臟、肝臟、脾臟及腎臟指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠臟器指數(shù)比較（xˉ± s）

2.3 血脂與正常組比較，模型組、薰倒牛正丁醇萃取部位中劑量組、陽性對照組CHOL 升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位高、中、低劑量組CHOL下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與正常組比較，模型組、陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位高劑量組TG升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，正丁醇高、中、低劑量組TG 下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠CHOL、TG變化情況

2.4 血糖給藥10 天后，與正常組比較，陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組血糖無顯著性差異（P＞0.05）；與模型組比較，陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組血糖下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），薰倒牛正丁醇萃取部位高劑量組血糖下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥20 天后，與正常組比較，薰倒牛正丁醇萃取部位低劑量組血糖無顯著性差異（P＞0.05），陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中劑量組、模型組血糖升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組血糖下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。給藥30 天后，與正常組比較，陽性對照組，薰倒牛正丁醇萃取部位低劑量組血糖無差異（P＞0.05）；與模型組比較，二甲雙胍組，薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組血糖下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），薰倒牛正丁醇萃取部位高劑量組血糖下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠給藥前后血糖變化情況（xˉ± s）

2.5 T-SOD、MDA、GSH-Px 及GHB與正常組相比，模型組、陽性對照組、正丁醇萃取高劑量組T-SOD下降明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組T-SOD升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組MDA 增高明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、薰倒牛正丁醇萃取部位低劑量組MDA下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組GSHPx 活性下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組GSH-Px 升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，其余各組GHB 升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，薰倒牛正丁醇萃取部位低劑量組GHB 降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠T-SOD、MDA、GSH-Px及GHB變化情況（xˉ± s）

2.6 大鼠腎臟病理學正常組大鼠腎臟腎小管、腎小球形態(tài)、結構均正常。模型組大鼠腎小球結構模糊，腎小管出現(xiàn)融合現(xiàn)象，排列紊亂，腎小管管腔擴張，腎小管內有分泌液。陽性對照組腎小球系膜細胞減少，腎小管排列規(guī)則，腎小球結構清晰。正丁醇高劑量組腎小管擴張，腎小球排列紊亂。正丁醇中劑量組腎小球系膜細胞減少，腎小管明顯擴張，腎小管內有分泌液。正丁醇低劑量組腎小管管腔狹窄，腎小管出現(xiàn)融合現(xiàn)象。見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理變化

2.7 大鼠胰腺病理學正常組胰腺腺泡及胰島完好，胰島多為圓形或者橢圓形細胞團，邊界清晰，胰島細胞排列緊密，分布均勻。模型組胰島體積減少，邊界模糊，形狀不規(guī)則，胰島細胞數(shù)量明顯減少，排列紊亂，部分細胞可見空泡變性。陽性對照組較模型組胰島細胞排列整齊，胰島細胞空泡樣變性的程度減輕。正丁醇高劑量組胰島細胞排列紊亂，部分細胞可見空泡變性。正丁醇中劑量組胰島形狀不甚規(guī)則，但邊界清晰，胰島細胞排列緊密，分布均勻。正丁醇低劑量組胰島縮小，胰島細胞完好。見圖3。

圖3 各組大鼠胰腺組織病理變化

3 討論

由于現(xiàn)代人生活水平的提高及飲食結構的變化導致糖尿病發(fā)病率居高不下，目前，2 型糖尿病的治療以西藥為主，包括降低血糖和促進胰島素生成藥物，這兩類藥物多為化學合成劑，降糖作用顯著，但會對患者產生副作用［7］，而中醫(yī)治療2 型糖尿病注重整體調節(jié)人體機能，降糖作用溫和、安全、可靠，對并發(fā)癥的防治效果明顯，且價格低廉［8］。因此，開發(fā)降血糖中藥新藥具有較好前景。

近年來，研究證明天然產物中的多種成分具有降血糖作用，比如黃酮類、三萜類、糖苷類、呫噸酮、多糖、糖苷和多肽［9］。寧萌等［10］研究發(fā)現(xiàn)，麥冬提取物具有降低糖尿病大鼠FBG、TG 的作用；孟慶海等［11］研究發(fā)現(xiàn)，桑葉提取物能夠降低糖尿病小鼠血糖。藏藥薰倒牛含有豐富的黃酮、生物堿、多糖成分［12-14］，尤其正丁醇萃取部位黃酮類成分豐富［15］，這些成分的降血糖作用值得進一步研究。

本實驗發(fā)現(xiàn)，薰倒牛正丁醇萃取部位可降低2 型糖尿病大鼠空腹血糖及TG、CHOL、GHB，可降低糖尿病大鼠肝臟中的MDA，升高T-SOD 及GSH-Px活性。本研究結果表明，薰倒牛正丁醇萃取部位中、低劑量組可改善糖尿病大鼠脂質代謝紊亂，減輕糖尿病大鼠氧化應激反應，降低糖尿病大鼠血糖。