抵當湯早期干預對2 型糖尿病大鼠血管內皮細胞黏附連接的影響*

張英俊，常 柏，譚力子

1 天津中醫藥大學，天津301617；2 天津醫科大學朱憲彝紀念醫院

2型糖尿病（type-2 diabetes mellitus，T2DM）由胰島素抵抗或胰島素分泌相對缺乏引起，其并發癥之一的大血管病變已成為糖尿病致死、致殘的主要原因，目前發現強化降糖并不能有效延緩大血管病變的發生［1］。糖尿病屬中醫“消渴”“脾癉”范疇，大血管病變是消渴日久，瘀血阻絡所致的變證。抵當湯出自《傷寒雜病論》，有破血逐瘀功效。前期試驗發現［2］，抵當湯可抑制血小板黏附以及血管內皮細胞（vascular endothelial cells，VEC）炎癥反應，從而延緩血管病變進程。動物實驗證明［3-4］，抵當湯早期干預可降低CD68、E-選擇素、TNF-α表達，上調NO、血清IL-4、IL-3，調節腺苷酸活化蛋白激酶，對糖尿病大血管起保護作用。VEC 結構及連接方式正常是保證血管完整性、穩定性、通透性的關鍵因素之一，而黏附連接最為廣泛。本研究觀察抵當湯對血管內皮細胞間黏附連接中各因子的影響，探究抵當湯對糖尿病大血管病變的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物雄性健康SD 大鼠150 只，4 周齡，體質量（105.9±5.1）g，由天津動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK2014-0001。予普通飼料適應性喂養，期間注意通風、溫度、濕度、整潔、光線等環境因素，定期更換墊料，自由飲水，飼養1 周后進行實驗。飼料包括普通飼料與高脂飼料，由天津實驗動物中心提供。

1.2 藥物抵當湯藥物組成：水蛭3 g，虻蟲1.5 g，桃仁5 g，熟大黃10 g，購買飲片后水煎，煎好減壓濃縮到每毫升1 g，置于4℃冰箱保存備用；二甲雙胍（施貴寶公司，批號：H20023770，規格：0.5 g/片）；辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司，批號：H19990366，規格：20 mg/片）。

1.3 試劑與儀器鏈脲佐菌素（STZ，美國sigma公司）；Western blotting 試劑盒（武漢博士得生物工程有限公司）；PCR 試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；胰島素放免測定試劑盒（天津九鼎醫學生物工程有限公司）；顯微鏡（日本奧林巴斯）；離心機（Eppendorf）；多功能真彩色細胞圖像分析管理系統（美國Media Cybernetics 公司）；熒光定量PCR儀（Applied Biosystems）。

1.4 方法

1.4.1 分組及造模 150 只大鼠適應性喂養1周。隨機選20只大鼠為正常對照組。其余130只大鼠高脂飼料喂養8 周，內眥靜脈取血測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）及血清胰島素水平（serum insulin level，Ins），計算胰島素抵抗指數（ISI=Ln［1/（FBG）（Fins）］），將出現胰島素抵抗的大鼠隨機選取20只作為抵當湯早期干預組，抵當湯灌胃4周。除正常對照組（等量枸櫞酸緩沖液）外其余大鼠尾靜脈注射STZ 溶液（30 mg/kg）。注射1周后測隨機血糖，血糖＞16.7 mmol/L為T2DM造模成功，共108 只。成模大鼠（除抵當湯早期干預組20只）按體質量、血糖分層，隨機分為5組，分別為：糖尿病模型組（18 只）、抵當湯中期干預組（17 只）、抵當湯晚期干預組（18 只）、二甲雙胍組（17只）、辛伐他汀組（18只）。

1.4.2 藥物干預及取材 按照人鼠等效劑量抵當湯2.05 g/（kg·d）、二甲雙胍160 mg/（kg·d）、辛伐他汀2.1 mg/（kg·d）進行灌胃，每日1 次，正常對照組和糖尿病模型組灌胃等劑量無菌飲用水，每日1 次。抵當湯早（成模前4 周）、中（成模時）、晚（成模后4 周）期組均等劑量給藥，二甲雙胍組、辛伐他汀組于成模時給藥。每2周測空腹及餐后血糖。24周結束喂養，頸椎脫臼處死取胸主動脈組織，部分用于HE 染色，部分置于液氮中速凍，-80℃低溫冰箱保存。

1.4.3 胸主動脈結構觀察 準備載玻片，將大鼠胸主動脈血管放入甲醛固定劑中24 h，沖洗酒精脫水，放入二甲苯和無水酒精溶劑中（1∶1），切片，展片、粘片，HE染色，光鏡下觀察胸主動脈結構。

1.4.4 Western blot 檢測血管內皮細胞鈣黏蛋白（VE-Cad）表達 取出大鼠胸主動脈，生理鹽水沖洗2遍，加入裂解液和PMSF，考馬斯亮藍法測細胞樣本蛋白含量，制備SDS-PAGE 膠，-80℃冰箱取出提取的總蛋白樣品插入冰中待融化，加入相應體積總蛋白樣品與5×蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液，放入凝膠孔進行電泳，凝膠轉模檢測，用非標記一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗對其進行孵育、檢測，用image J軟件分析灰度值。

1.4.5 Rap1、MAGI1、Tie2 表 達 檢測 用SYBR GreenⅠReal-Time PCR 方法檢測大鼠血管組織Rap1 相關蛋白1（Rap1）、膜相關鳥苷酸激酶1（MAGI1）、酪氨酸蛋白激酶2（Tie2）表達。使用超純RNA 提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取組織樣本中總RNA，取5 μL RNA 用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳，用DNaseⅠ試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat# CW2090）對RNA 中殘留的基因組DNA 進行消化處理，用HiFi-MMLVcDNA 第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）進行反轉錄，儀器使用ABI 7500 型熒光定量PCR 儀，分析方法采用2-△△CT 法對數據進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統計學方法采用SPSS 17.0 分析數據，計量資料以xˉ±s表示，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗，多樣本均數比較采用方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間方差齊采用LSD 法，方差不齊采用Dunnet T3法，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 胸主動脈內皮細胞變化光鏡下正常對照組動脈內膜較光滑，中膜及彈力膜排列相對規則，平滑肌細胞無變性；糖尿病模型組動脈內膜不完整，內皮細胞（endothelial cells，EC）大部分缺失，脂質沉積，中膜排列較亂，平滑肌細胞有少量變性、壞死，與對照組比較損傷較重；抵當湯早期組與辛伐他汀組動脈內膜相對完整，EC 局部缺失，有少量脂質沉積，中膜排列較整齊，平滑肌細胞少見變性、壞死，與模型組相比損傷較輕；抵當湯中期組及二甲雙胍組動脈內膜較光滑，局部EC缺失，中膜排列較紊亂，少量平滑肌細胞變性、壞死；抵當湯晚期組內膜不完整，EC 缺失，中模排列紊亂，平滑肌變性、壞死。見圖1。

圖1 光鏡下大鼠胸主動脈病理改變（HE，×400）

2.2 VE-Cad 表達情況與正常對照組比較，糖尿病模型組胸主動脈VE-Cad 的表達下降,差異具有統計學意義（P＜0.05），抵當湯早期組、二甲雙胍組、辛伐他汀組胸主動脈VE-Cad 的表達無明顯差異（P＞0.05）；與糖尿病模型組比較，抵當湯早、中期組、辛伐他汀組胸主動脈VE-Cad 表達上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與抵當湯晚期組比較，抵當湯早期組和辛伐他汀組胸主動脈VE-Cad的表達上升，差異有統計學意義（P＜0.05），二甲雙胍組無明顯差異（P＞0.05）；抵當湯早期組和二甲雙胍組、辛伐他汀組之間比較，無明顯差異（P＞0.05）。見圖2—3。

圖2 各組大鼠VE-Cad的表達（xˉ± s）

圖3 各組VE-Cad電泳條帶圖

2.3 Rap1、MAGI1 及Tie2 基因表達情況與正常對照組比較，抵當湯早期組、辛伐他汀組胸主動（P＞0.05），糖尿病模型組Rap1、MAGI1、Tie2 mRNA的表達下降,差異具有統計學意義（P＜0.05）；與糖尿病模型組比較，抵當湯早、中期組、二甲雙胍組、辛伐他汀組Rap1、MAGI1、Tie2 mRNA 的表達上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；與抵當湯晚期組比較，抵當湯早、中期組、二甲雙胍組和辛伐他汀組Rap1、MAGI1、Tie2 mRNA 的表達明顯上升，差異有統計學意義（P＜0.05）；抵當湯早期組和辛伐他汀組比較無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血管內皮Rap1、MAGI1、Tie2基因的表達（xˉ± s）

3 討論

血管內皮屬機體最大的內分泌器官之一［5］，其EC 結構、連接方式正常，才能實現血管內皮功能，內皮功能的損害已被認為是糖尿病血管病變的早期病變信號［6-7］。在VEC 連接中，緊密連接和縫隙連接穿插于黏附連接中，且黏附連接分布更廣泛［8］，黏附連接與血管內皮的通透性有關，通透性的改變會加劇動脈粥樣硬化，推動大血管病變的發生發展。

VE-Cad 屬鈣黏蛋白家族成員，能特異性表達在VEC 上，黏附連接以VE-Cad 為中心，VE-Cad 通過β-catenin、γ-catenin 與肌動蛋白細胞骨架相關的α-catenin 相連，形成鈣黏蛋白-聯蛋白復合體。VE-Cad 在Ca2+存在下形成二聚體，進一步與相鄰的細胞順二聚體反式結合，形成EC 黏附連接結構，維持血管內皮穩定。VE-Cad 主要位于細胞連接的中上層，最先、也最容易受到外界刺激而產生一系列變化。其中，VE-Cad 在通透性調節方面可能是由于鈣黏蛋白-聯蛋白復合體酪氨酸磷酸化及去磷酸化導致了通透性增加。研究顯示［9］，VE-Cad 是維護血管內皮結構和功能完整性所必須的物質，且可作為監測糖尿病大血管病變的指標。

Rap1 屬小分子G 蛋白Ras 超家族成員，Rap1影響細胞間黏附連接的定位及其完整性［10］。在EC 連接形成初期部位，VE-Cad 在細胞間連接部位激發Rap1 活性化，使得Rap1 活性上升。Rap1 亦可促進VE-Cad 表達，穩定VE-Cad 形成的黏附連接［11］。MAGDALENA 等［12］在STZ 誘導的糖尿病模型中發現，Rap1 可增強細胞黏附、穩定血管，還可防止高通透性。

MAGI1 屬MAGUK 支架蛋白家族，通過定位于細胞間接觸而起支架分子作用。 ATSUKO［13］認為MAGI1 在連接β-catenin 后利于Rap1 激活；消耗MAGI1 會削弱黏附連接；在細胞連接處MAGI1 與VE-Cad 和β-catenin 形成復合物且其介導的信號可增強VE-Cad介導的黏附連接。

Tie2 特異性表達在EC 上，和血管生成素1（Ang-1）組成的受體系統具有抵抗凋亡、抑制炎癥反應、維持血管穩定、減輕血管滲漏等作用，有研究證明Ang-1/Tie2 信號經Rap1 介導增強VE-Cad連接，使血管結構穩定。Tie2 單抗本身也可激活Ang-1/Tie2信號系統，而單獨抑制Tie2的表達會增加血管內皮通透性。有學者研究發現，Ang-1/Tie2會對血管內皮細胞鈣依賴黏連蛋白復合物產生影響。

抵當湯是破血逐瘀要方，其中水蛭、虻蟲均炒制，大黃久煎。現代研究認為水蛭［14］、虻蟲可快速結合凝血酶，抑制纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，降低凝血，或直接結合凝血酶溶解血栓。大黃能影響黏附蛋白表達，改善VEC 活性物質分泌，減輕血管炎性病變，降低血液黏稠度，起到抗血栓、抗動脈粥樣硬化等作用。桃仁［15］能使大鼠TRIB3 基因、TLR4 蛋白及MAPK mRNA 表達降低，抑制大血管纖維化，從而對本病的纖維化起改善作用。

糖尿病大血管病變屬中醫“脈痹”范疇［16-17］，《素問·脈要精微論篇》中“五臟脈搏堅”可與動脈硬化相關聯，屬消渴兼證，其總病機為陰虛燥熱，漸至氣陰兩虛，隨著病程的延長最終導致陰損及陽，陰陽兩虛。仝小林［18-20］認為消渴患者大多經歷“郁、熱、虛、損”4個階段，且瘀血貫穿始終。

本研究結果顯示，糖尿病模型組大鼠VE-Cad、Rap1、MAGI1、Tie2表達低于正常對照組，與上述結果一致，辛伐他汀組、抵當湯早、中期組各指標水平高于糖尿病模型組，且早期組優于晚期組，光鏡下大鼠胸主動脈結果顯示糖尿病早期給予抵當湯干預可改善糖尿病大血管病變細胞間連接，增強VEC 黏附連接，增強血管穩定性，改善血管通透性，減輕血管內皮損傷，延緩糖尿病大血管病變的發生、發展。然而，血管內皮細胞間連接機制復雜，其中抵當湯的治療中是否有更多重要因子參與仍需進一步研究。