miR-10b、LMP1和Twist1聯合檢測在鼻咽癌早期診斷及復發診斷中的應用

魏曉 陳鵬 張艷

鼻咽癌是一類高發惡性腫瘤，多發生于咽隱窩、鼻咽頂壁等處，目前全球范圍內每年發病人數高達八萬以上，病死人數接近五萬［1-2］。研究顯示，該病對放化療表現出較高的敏感性，患者在疾病發現早期進行積極治療后五年生存率可達到80%，但部分患者進展至中晚期后腫瘤遠端轉移、局部浸潤程度較高，其預后生存情況并不理想［3-4］。微小RNA（microRNA，miRNA）作為參與細胞增殖、代謝、凋亡的重要RNA 分子，在機體腫瘤、炎癥病變中發揮重要參與作用［5］。其中miR-10b基因可在肝癌、腎癌等多種惡性腫瘤患者腫瘤侵襲、轉移中出現表達異常；與潛伏膜蛋白1（Latent membrane protein 1，LMP1）相關的EB 病毒與鼻咽癌關系緊密，LMP1 作為此類病毒的基因產物，具有一定的癌基因功能，可參與此類疾病病情進展［6-7］；Twist 相關蛋白1（Twist related protein 1，Twist1）則在褐色脂肪代謝、胚胎發育中作用關鍵，其可于多種腫瘤中有所表達［8］。目前臨床對上述指標與鼻咽癌診斷的研究較少，本次研究將探究其水平在鼻咽癌早期診斷以及復發診斷中的效能?，F將所得成果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2019年12月期間于鄭州頤和醫院行各項檢查的82 例疑似鼻咽癌受檢者臨床資料，根據后續實際診斷結果分為確診組51 例與未確診組31 例，將確診組根據后續實際復發情況分為復發組23 例與未復發組28 例。納入標準：①均于本院接受各項相關檢查；②復發組患者均符合中國抗癌協會鼻咽癌專業委員會制定的《復發鼻咽癌治療專家共識》相關診斷標準［9］；③所有人員均為初次診治，未經相關治療，且臨床資料保存完整。排除標準：①存在嚴重感染狀態者；②合并頜面部周圍組織嚴重病變或其他類型惡性腫瘤者。受檢者一般資料：男62 例，女20 例；平均年齡（46.39±12.36）歲。確診組患者TNM 分期［10］：Ⅰ期11 例，Ⅱ期40 例；腫瘤轉移情況：伴淋巴結轉移33例，無淋巴結轉移18 例。

1.2 方法

采用實時熒光定量PCR 法檢測血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，收集受檢者靜脈血10 mL，經3 500 r/min 離心10 min 后分離血清，采用Trizol reagent RNA 提取試劑盒對血清中RNA 進行提取檢測，并以Nanodrop 判斷RNA 濃度，隨后將RNA 作為模板逆轉錄合成cDNA，miR-10b上游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAAATT-3′，下游引物序列：5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；LMP1上游引物序列：5′-ACACACTGCCCTGAGGATG-3′，下游引物序列：5′-TGAGCAGGAGGGTGATCA-3′；Twist1上游引物序列：5′-CAAGCTGCAGCTATGTGGC-3′，下游引物序列：5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGG-3′。miR-10b在95℃下進行30 s 預變性以及5 s 變性，隨后60℃下進行30 s 退火，并于70℃進行30 s 延伸，循環共持續40 個；LMP1、Twist1 在95℃下進行60 s 預變性以及20 s 變性，隨后58℃下進行25 s 退火，并于70℃進行30 s 延伸，循環同樣持續40 個。隨后通過2-ΔΔCT法對上述三個指標相對表達量進行測定。

1.3 觀察指標

比較確診組與未確診組血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，采用受試者工作特征（ROC）曲線評估上述指標各自對鼻咽癌的早期診斷效能及聯合診斷效能；比較復發組與未復發組血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，采用ROC 曲線評估上述指標各自對鼻咽癌復發的診斷效能及聯合診斷效能。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 21.0 分析數據，計量資料用（）表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較，診斷效能分析采用ROC 曲線，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 確診組與未確診組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較

確診組血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平均顯著高于未確診組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 確診組與未確診組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較（±s）Table 1 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between confirmed group and unconfirmed group（±s）

表1 確診組與未確診組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較（±s）Table 1 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between confirmed group and unconfirmed group（±s）

組別確診組未確診組t 值P 值n 51 31 miR-10b 7.86±1.42 5.78±1.03 7.092＜0.001 LMP1 mRNA 4.83±0.92 3.32±0.76 7.678＜0.001 Twist1 mRNA 4.12±0.89 2.78±0.65 7.278＜0.001

2.2 血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA早期診斷鼻咽癌的效能分析

血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 聯合早期診斷鼻咽癌的ROC 曲線AUC 為0.978，優于單一診斷（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 ROC 曲線參數Table 2 ROC curve parameters

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

復發組miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA水平均顯著高于未復發組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 復發組與未復發組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較（±s）Table 3 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between recurrence group and non-recurrence group（±s）

表3 復發組與未復發組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較（±s）Table 3 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between recurrence group and non-recurrence group（±s）

組別復發組未復發組t 值P 值n 23 28 miR-10b 8.76±1.02 7.12±1.26 5.030＜0.001 LMP1 mRNA 5.44±0.92 4.32±0.97 4.198＜0.001 Twist1 mRNA 4.62±0.86 3.70±0.75 4.080＜0.001

2.4 血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA診斷鼻咽癌復發的效能分析

miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 診斷鼻咽癌復發的ROC 曲線AUC 分別為0.804、0.818、0.733，三者聯合診斷AUC 為0.932（P＜0.05），見表4、圖2。

表4 ROC 曲線參數Table 4 ROC curve parameters

圖2 ROC 曲線Figure 2 ROC curve

3 討論

鼻咽癌是國內頭頸部惡性腫瘤中常見的類型，早期診斷及治療極為重要，目前放療作為其早期主要治療方式具備顯著療效，但不良反應較多，且面臨局部復發、轉移風險［11］，故臨床仍需進一步探究用于其早期診斷及復發診斷的標志物。

人類2q31 HOXD 基因簇中的miR-10b編碼基因可通過與下游靶基因3'-非編碼區相結合達成對多種靶基因表達的調控，在機體出現心血管病變、自身免疫性疾患以及惡性腫瘤后，其表達可發生明顯異常變化。孫秀英等［12］研究發現鼻咽癌患者癌組織miR-10b 與LMP1、Twist1mRNA 的表達呈正相關，與鼻咽癌腫瘤TNM 分期亦有顯著相關性。王述蓮等［13］研究發現，乳腺癌患者發病過程中可伴隨miR-10b 水平的上升，而在相關體外實驗中亦發現miR-10b 可促進腫瘤細胞侵襲過程。EB病毒作為一類嗜淋巴細胞病毒，在人體感染后大多處于潛伏狀態，而在腫瘤病情進展等條件下可進行二次復制，并通過病毒編碼產生LMP1，以達到促進腫瘤細胞增殖、抑制其凋亡并誘導B 淋巴細胞分化的作用。陳俊妮等［14］研究發現，LMP1 與鼻咽癌患者腫瘤分期、頸部淋巴結體積等具有顯著相關性，可作為預測鼻咽癌遠處轉移的重要分子標志物。本研究中，上述兩種指標均在確診組患者中呈高表達水平，且腫瘤復發患者表達水平高于未復發患者。ROC 曲線分析發現，miR-10b、LMP1 在鼻咽癌早期診斷及復發診斷中效能顯著，與上述研究結果相似。此外，miR-10b 屬于致癌miRNA，可對巖藻糖基轉移酶8 發揮一定調控作用，使蛋白激酶信號通路得以激活，從而加劇腫瘤細胞增殖及局部浸潤，另一方面，其表達水平的上升可對同源性磷酸酶張力蛋白基因等抑癌基因表達產生一定抑制作用，有利于腫瘤細胞增殖。吳克復等［15］研究指出，EB 病毒隱性感染可誘發免疫失調，引起機體免疫失控、局部淋巴增生及超炎癥狀態，有助于鼻咽癌等惡性腫瘤形成，此外EB 病毒感染引發的代謝類型改變亦可支持病毒持續感染，此類改變亦可能導致腫瘤發生。在鼻咽癌發生后EB 病毒可從潛伏狀態活化，從而導致LMP1mRNA 水平上升，使LMP1作為活性受體激活蛋白激酶途徑、核因子κB 等多種胞內信號通路，使血管內皮生長因子、基質金屬蛋白酶等癌基因表達上升，促進腫瘤增殖、遷移。

Twist1基因可參與神經管閉合、神經發育以及褐色脂肪代謝等過程的調節，其屬于堿性螺旋-環-螺旋蛋白家族中高度保守的轉錄因子，在胚胎發育過程中可調節組織重建，達到促進細胞遷移的作用，此外Twist1亦是促進多種腫瘤轉移、侵襲的關鍵基因，在鼻咽癌轉移中也可發揮重要作用［16］。本研究中，Twist1 在確診組及復發組中表達水平更高，且經ROC 曲線分析發現，Twist1 在鼻咽癌早期診斷及復發診斷中效能顯著，與上述研究背景相似。分析其原因，Twist1 作為轉錄因子可誘導上皮間質轉化，使上皮細胞發生形態學改變向間充質細胞表型轉變，并因此獲得遷移能力，使上皮細胞或組織分離、遷移至其他部位。故認為Twist 誘導上皮間質轉化程序為鼻咽癌轉移啟動的重要原因。

綜上所述，血清miR-10b、LMP1、Twist1 可應用于鼻咽癌早期診斷及復發診斷，其聯合應用可表現出更佳診斷效能。