TGR、LGR5聯合RRM1檢測在非小細胞肺癌疾病進展中的評估作用

李琪 王繼靈 曹榮娟 劉秀珍 孟祥云★

腫瘤生長速率（tumor growth rate，TGR）是近年興起的一種新型指標，能動態定量觀察腫瘤進展速度，適合監測靶向治療的療效［1-2］。富含亮氨酸的G 蛋白偶聯受體5（Leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor5，LGR5）是結直腸癌干細胞表面標志分子，與腫瘤的生長、侵襲和不良預后相關，近年有研究發現LGR5 在肺癌中也有表達［3-4］。核苷酸還原酶M1（ribonucleotide reductase subunit M1，RRM1）作為核苷酸切除修復的限速酶，是一種抑癌基因，其異常表達與非小細胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCLC）的疾病進展、侵襲、轉移等亦有緊密聯系［5-6］。本研究就既往LGR5、RRM1 在NSCLC 中的意義及預后評估的基礎上，進一步研究TGR 與其聯合檢測在NSCLC 進展中的評估作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2018年1月于合肥市第二人民醫院就診的97 例NSCLC 患者。納入標準：①均由組織病理學診斷證實為非小細胞肺癌患者［7］；②均為初次治療的患者；③有完整的病歷資料及影像學圖像。排除標準：①多原發惡性腫瘤，有嚴重基礎疾病；②合并彌漫性血管內凝血等血液系統疾病者；③妊娠期或哺乳期婦女。取所有患者術中新鮮肺癌組織及對應癌旁組織（距離癌組織5 cm 處）標本，分別作為NSCLC 組和對照組。本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過，受試者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

1.2.1 TGR

通過以下公式計算術前TGR［8］：TGR=100［exp（TG）-1］，其中TG=3log（Dt/D0）/t，D0、Dt 分別為基線及第1 次療效評價時靶病灶最大直徑總和，t 為2 次腫瘤評估間隔的時間。本文遵循實體瘤的療效評價標準（Response Evaluation Criteria In Solid Tumors，RECIST）［9］標準測量靶病灶，排除基線時僅存在非靶病灶（如僅有胸腔積液或骨轉移）及第1 次療效評價時出現新發病灶的患者。利用受試者操作特征曲線找到TGR 最佳截斷點為9.74，以此為界分為TGR 升高和TGR 降低。

1.2.2 LGR5、RRM1

1.2.2.1 主要試劑：兔抗人LGR5 多克隆抗體購自美國Epitomics 公司；RRM1 一抗抗體、二抗和S-P免疫組化試劑盒購自福建邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2.2 免疫組織化學檢測：將3 mm 厚的石蠟組織切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。體積分數3%過氧化氫處理阻斷內源性過氧化物酶，0.01 μmol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 值6.0）高壓水浴加熱，抗原修復2 min，質量分數3%牛血清白蛋白封閉，阻斷非特異性染色。分別以兔抗人LGR5 多克隆抗體（1∶150）與RRM1 一抗抗體為一抗，檢測LGR5、RRM1。

1.2.2.3 結果判定標準［10］：RRMl 以細胞漿呈棕黃色為陽性，LGR5 陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細胞質和細胞膜。陽性細胞百分率（A 值）評分：＜25%為1 分，25%～50%為2 分，＞50%為3 分；染色強度（B 值）評分：不著色為0 分，淺棕黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩種計分的乘積為每例的加權分數，加權分數為0 為陰性，其余均為陽性。

1.3 隨訪方法

隨訪從患者術后開始，直至患者死亡或隨訪結束，為期3年，截止于2021年1月。隨訪的方式主以患者來院復查為主，隨訪率為100.00%。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計數資料以n（%）表示，行χ2檢驗；計量數據以（）表示，行t檢驗；采用多元Logistic 回歸分析影響預后生存的危險因素，采用ROC 曲線分析不同方法的預測價值，繪制Kaplan-Meier 生存曲線研究TGR、LGR5、RRM1 對患者預后生存的影響；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組TGR、LGR5、RRM1 表達情況比較

NSCLC 組LGR5 陰性率及RRM1 陽性率高于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組TGR、LGR5、RRM1 表達情況比較［n（%）］Table 1 expression comparison of TGR，Lgr5 and RRM1 between the two groups［n（%）］

2.2 TGR、LGR5、RRM1 表達與NSCLC 患者病理參數的相關性

中低分化、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結侵犯者TGR 升高率、LGR5 陰性率及RRM1 陽性率高于高分化、Ⅰ+Ⅱ期及無淋巴結侵犯者，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 TGR、LGR5、RRM1 表達與NSCLC 患者病理參數的相關性［n（%）］Table 2 Correlation between expression of TGR，Lgr5 and RRM1 and pathological parameters of NSCLC patients［n（%）］

2.3 影響NSCLC 患者預后生存的單多因素分析

截至隨訪結束，97 例NSCLC 患者生存59 例，死亡38 例，死亡率為39.18%。中低分化、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結侵犯、TGR 升高、LGR5 陰性及RRM1陽性表達為影響NSCLC 患者預后生存的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響NSCLC 患者預后生存的單因素和多因素分析Table 3 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with NSCLC

2.4 TGR、LGR5 聯合RRM1 檢測在預測NSCLC患者預后生存中的價值分析

TGR、LGR5、RRM1 單項及聯合檢測AUC 分別為0.820、0.715、0.821、0.905，各指標AUC 以聯合檢測最大（P＜0.05）。見表4、圖1。

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

表4 TGR、LGR5、RRM1 單項及聯合檢測水平對預測NSCLC 患者預后生存的預測價值Table 4 predictive value of TGR，Lgr5，RRM1 single and combined detection levels in predicting prognosis and survival of NSCLC patients

2.5 TGR、LGR5、RRM1 與NSCLC 患者預后生存的關系

TGR 高表達的平均生存時間為（29.87±2.42）個月，低于TGR 低表達組平均生存時間（41.09±6.42）個月，差異有統計學意義（t=11.534，P＜0.05）。LGR5 陰性組的平均生存時間為（31.65±2.09）個月，低于LGR5 陽性組平均生存時間（39.35±4.47）個月，差異有統計學意義（t=6.309，P＜0.05）。

RRM1 陰性組的平均生存時間為（38.64±3.85）個月，高于RRM1 陽性組平均生存時間（32.11±2.72）個月，差異有統計學意義（t=5.880，P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同TGR、LGR5、RRM1 表達情況下Keplan-meier生存曲線Figure 2 Keplan-meier survival curve under the circumstance of different expressions of TGR，LGR5 and RRM1

3 討論

TGR 定義為1 個月內腫瘤體積增加的百分比［11］。目前研究發現，TGR 在腎癌、乳腺癌、結直腸癌等多種腫瘤中與總體生存期（Overall Survival，OS）顯著相關，尤其在腎癌領域，TGR 已經進入臨床決策層面，直接影響治療方案的選擇及預后的評估［12-13］。因此，TGR 可能成為評價抗腫瘤治療是否改變疾病進程的有用工具。本研究結果顯示，在NSCLC 組織中以TGR 升高為主，且TGR 與NSCLC 多種病理參數關系密切，提示TGR 升高促進NSCLC 的侵襲與轉移。Kaplan-Meier 生存曲線分析結果顯示TGR 升高人群生存期短、預后差，與既往研究［14］趨勢類似，進一步提示臨床可加強對NSCLS 患者TGR 的檢測，進而改善預后。

LGR5 是含有18 個富含亮氨酸的重復單位和7 個跨膜區域組成的大分子蛋白，為G 蛋白偶聯受體家族的成員之一。國外研究顯示：LGR5 在人體正常組織中的表達表現出局限性，而在卵巢、胃腸道、基底細胞癌及肝臟等腫瘤組織中，LGR5 的表達均有不同程度的改變［15］。本研究結果基本與上述研究一致，提示了LGR5 在癌癥的發生、發展中可能起到了至關重要的作用。此外，研究發現LGR5 是Wnt 信號通路中的靶基因，當信號通路異常激活時，引起LGR5 的表達顯著降低，可能對NSCLC 癌組織中上皮細胞的惡性轉化起到重要作用［16］。而本組數據Kaplan-Meier 生存曲線中顯示LGR5 陰性組生存時限低于陽性組，提示LGR5 的表達與非小細胞肺癌患者預后生存有著密切聯系。

核苷酸還原酶（ribonucleotide reductase，RR）是一種限速酶，在DNA 合成通路中起作用。目前，臨床上對于RRM1 的研究主要集中于其表達水平與惡性腫瘤患者預后相關性。相關研究顯示，RRM1 表達直接影響到了NSCLC 化療耐藥性［17］。本組數據顯示：NSCLC 患者RRM1 陽性表達率顯著升高，是影響患者預后生存的獨立危險因素，且進一步Kaplan-Meier 生存曲線分析得RRM1 陽性患者平均生存時間顯著短于陰性組提示RRM1 檢測對NSCLC 患者疾病進展及預后具有積極的預測作用。ROC 曲線結果顯示各指標AUC 以聯合檢測最大，故聯合檢測的預測價值最佳，表明TGR、LGR5、RRM1 三項聯合提高了臨床評估NSCLC 患者預后的敏感度，值得在臨床廣泛推廣。

綜上所述，TGR、LGR5、RRM1 與NSCLC 疾病進展、預后均有著密切關系，可作為預測患者預后生存的分子標志物和腫瘤治療的潛在靶點。