短暫性腦缺血發作患者ABCD2評分與外泌體miR-450b-5p水平的關系

錢臘燕 武曉芳 劉彥龍 凡奇 馬龍

短暫性腦缺血發作（transient ischemic attack，TIA）是指在一定時間內發生缺血同時又迅速緩解的癥狀，癥狀持續時間短，一般1～24 h 內即可恢復正常［1-2］。近年來，臨床研究發現約有50%的TIA 患者在發病后的48 h 內進展為缺血性卒中（ischemic stroke，IS），具有較高的危險系數［3］。故早期診斷和治療TIA 對于預防IS 的發生具有重要意義。miRNA 在血管性疾病、腫瘤等多種疾病中具有重要的調控作用［4-5］。既往研究發現miR-450b-5p 不僅與惡性腫瘤發生發展密切相關，還參與多種炎癥性疾病［6］。Huang 等人［7］研究顯示miR-450b-5p 通過抑制αB-晶狀體蛋白可改善肝臟缺血性損傷。Luo 等人［8］通過生物信息學分析發現miR-450b-5p 可調控信號通路活性改變，影響腦組織細胞的生物活性，這為后期研究提供了思路。因此，本研究通過觀察不同危險分級以及預后TIA 患者外泌體miR-450b-5p 表達水平，旨在初步探討外泌體miR-450b-5p 在TIA 發生發展中的作用，為臨床診治TIA 提供一定的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取亳州市人民醫院2017年1月至2019年6月診治的142 例TIA 患者作為TIA 組。納入標準：①符合2009年美國心臟協會/腦卒中協會制定的TIA 診斷標準［9］，并經影像學檢查確診；②患者臨床資料完整。排除標準：①經CT 或MRI 檢查證實為新發梗死病灶導致；②經CT 或MRI 檢查證實為顱內出血、感染等其他神經系統疾病；③既往存在腦卒中病史；④合并嚴重臟器功能不全、自身免疫性疾病者；⑤近半年內存在腦部手術或外傷史。其中男109 例，女33 例；平均年齡（53.49±8.16）歲；基礎疾病：高血壓24 例，糖尿病29 例。另選取同期來本院體檢的133 例健康人作為對照組，其中男104 例，女29 例；平均年齡（52.67±7.92）歲。兩組基線資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有較好的可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過，受試者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

TIA 組患者入院后次日、對照組于體檢當日清晨抽取空腹靜脈血3 mL，室溫下以3 000 r/min 的速度離心10 min，收集上層血清，然后在4℃、14 000 r/min 的條件下，離心10 min，取上層清液保存于-80℃。將上清液經0.22 gm 濾膜過濾，DPBS 洗兩次，收集截留物，經戊二醛固定，檸檬酸鉛染色，再通過透射電鏡法觀察提取外泌體。采用Trizol 法提取外泌體中的總RNA 分子，并參考miRcute 血清miRNA 提取分離試劑盒說明書提取外泌體中的miR-450b-5p，采用實時熒光定量PCR 檢測外泌體miR-450b-5p 水平。反應條件按照試劑盒說明書進行：第一階段，95℃30 s 預變性，1 個循環；第二階段，95℃5 s、60℃30 s，40 個循環。以小核RNAU6作為內參，對目標基因進行歸一化處理。目標miRNA 的相對表達量=2-ΔΔCT，CT 值為反應體系中熒光信號達到閾值時的循環數。患者入院時或者TIA發作后進行ABCD2 評估，評估標準［10］如下：A：年齡≥60 歲，計為1 分；B：血壓≥140/90 mmHg，計為1分；C：臨床表現：單側肢體無力計為2 分，有言語障礙而無肢體無力，計為1 分；D 癥狀持續時間：≥60 min，計為2 分，10～59 min，計為1 分；D 糖尿病：口服降糖藥或應用胰島素治療，計為1 分。其中低危組為0～3 分，中危組為4～5 分，高危組為6～7 分。

1.3 觀察指標

比較TIA 組與對照組miR-450b-5p 水平，并比較不同危險分級TIA 患者ABCD2 評分、外泌體miR-450b-5p 水平，并分析兩者相關性。通過電話或者門診形式隨訪，統計患者90 d 內是否發生腦梗死、死亡、大動脈狹窄等不良事件，根據有無發生將患者分為預后不良組和預后良好組，比較兩組患者ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p 水平，并通過ROC 曲線分析兩者對預后的預測價值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計軟件進行統計處理，計量資料數據均符合正態分布，以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素-方差（F檢驗）分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。ABCD2 評分、外泌體miR-450b-5p 水平相關性采用Pearson 相關分析。ABCD2 評分、外泌體miR-450b-5p 水平對TIA 患者預后的預測價值采用受試者工作特征（ROC）曲線分析；以ROC 曲線下面積值（AUC）反映預測效能，AUC 值的比較采用Z 檢驗；以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TIA 組與對照組外泌體miR-450b-5p 水平比較

TIA 組外泌體miR-450b-5p 表達水平為（0.64±0.20），明顯低于對照組外泌體miR-450b-5p表達水平（0.98±0.34），差異有統計學意義（t=10.134，P＜0.05）。

2.2 不同危險分級患者ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p 水平比較

ABCD2 評分：高危組＞中危組＞低危組、外泌體miR-450b-5p 表達水平：高危組＜中危組＜低危組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同危險分級患者ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p 水平比較（±s）Table 1 ABCD2 scores and exosome miR-450b-5p levels in patients with different risk classification（±s）

表1 不同危險分級患者ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p 水平比較（±s）Table 1 ABCD2 scores and exosome miR-450b-5p levels in patients with different risk classification（±s）

注：與低危組比較，aP＜0.05；與中危組比較，bP＜0.05。

分組低危組中危組高危組F 值P 值n 46 67 29 ABCD2 評分（分）2.22±0.63 4.46±0.52a 6.41±0.50ab 530.298＜0.001外泌體miR-450b-5p 0.84±0.26 0.65±0.19a 0.31±0.12ab 59.678＜0.001

2.3 ABCD2評分與外泌體miR-450b-5p水平相關性

外泌體miR-450b-5p 水平與ABCD2 評分呈負相關（r=-0.611，P＜0.05）。

2.4 不同預后患者ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p 水平

所有患者均完成隨訪，根據有無發生不良事件將患者分為預后不良組（n=38）和預后良好組（n=104）。預后良好組患者ABCD2 評分明顯低于預后不良組，外泌體miR-450b-5p 水平明顯高于預后不良組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同預后患者ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p水平（±s）Table 2 ABCD2 scores and exosome miR-450b-5p levels in patients with different prognosis（±s）

表2 不同預后患者ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p水平（±s）Table 2 ABCD2 scores and exosome miR-450b-5p levels in patients with different prognosis（±s）

分組預后良好組預后不良組t 值P 值n 104 38 ABCD2 評分（分）3.85±1.71 4.90±1.38 3.400 0.001外泌體miR-450b-5p 0.72±0.21 0.43±0.18 7.555＜0.001

2.5 ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p 水平對預后的預測價值

外泌體miR-450b-5p 聯合ABCD2 評分評估TIA 預后的AUC 為0.819，大于兩者單獨檢測（P＜0.05），兩者聯合預測的敏感度為84.21%，特異度為69.27%。見表3、圖2。

表3 ABCD2 評分和外泌體miR-450b-5p 水平對預后的預測價值Table 3 The prognostic value of ABCD2 score and exosome miR-450b-5p level

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curves

3 討論

目前臨床認為TIA 的發病與血流動力學變化以及微栓子形成有關，是IS 的先兆性癥狀，其反復發作最終可發展為不可逆的腦梗死［11］。既往研究表明影像學檢查對于TIA 病情評估方面仍存在一定的局限性［12］。國內外已有多項研究表明外泌體miRNAs 可能與TIA 的發生發展密切相關［13-14］，Luo 等人［8］以TIA 大鼠為對象，通過一系列試驗證實miR-450b-5p 對于TIA 大鼠具有較高的診斷價值，可能成為大鼠TIA 的生物學標志物及治療靶點。但miR-450b-5p 水平與人體TIA 的關系尚處于初步研究階段，國內外鮮有報道。

既往研究表明外泌體是miRNAs 的運載體和富含體，在腦缺血后的幾分鐘開始，腦組織將出現包括基因表達變化等各種各樣的由缺血直接導致的功能損害［15］。本研究發現miR-450b-5p 水平在TIA 中明顯降低，Luo 等人［8］研究也表明TIA 大鼠中miR-450b-5p 水平顯著降低。另研究結果提示miR-450b-5p 可能參與TIA 的發生發展過程中，可與ABCD2 評分共同用于TIA 患者病情進展的監測。TIA 與IS 的癥狀相同，具有相似的病理生理機制，包括鈣離子代謝異常、氧化應激、細胞凋亡、免疫反應等。而新的研究表明miRNAs 參與了淋巴細胞的形成和分化過程，從而參與調控免疫反應環節，間接參與腦缺血的發生［16］。在眾多的miRNAs 中，miR-450b-5p 也是一個免疫相關性miRNA。Li 等人［17］研究表明miR-450b-5p 與核因子-kB（Nuclear factor-kB，NF-kB）表達增強密切相關，且miR-450b-5p 在免疫反應的早期以及炎癥反應各階段發揮作用。而TIA 患者因腦缺血的發生，血腦屏障被破壞，促使炎癥反應發生，誘導NF-κB的激活，參與TIA 后炎癥反應，進一步加重腦損傷的發生，促進TIA 病情進展。Zhang 等人［18］研究表明miR-450b-5p 靶基因還與鈣離子轉運、基因表達調節、細胞粘附調節、轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β 信號通路、MAPK 信號傳導等有關。如MAPK 途徑作為保護血腦屏障的關鍵途徑，可促進腦梗死后血管生成；細胞內鈣離子濃度升高、細胞凋亡以及線粒體損傷均是引起大腦中動脈阻斷后缺血性再灌注損傷的重要因素；ABCD2 評分是現階段常用的預測TIA 進展為IS 風險以及預后的評估工具，具有快捷、操作簡單、經濟等優點，但其評估指標未涉及病理生理因素、影像學檢查結果，故單純依靠ABCD2 評分預測TIA 預后尚存在一定的局限性。本研究以患者不同預后進行分組，結果顯示外泌體miR-450b-5p 聯合ABCD2 評分評估TIA 預后的AUC 明顯大于兩者單獨診斷，兩者聯合預測的敏感度為84.21%，特異度為69.27%，提示外泌體miR-450b-5p 可與ABCD2 評分聯合為TIA 的預后預測提供一定的參考。

綜上所述，TIA 患者外泌體miR-450b-5p 表達水平與ABCD2 評分呈負相關，兩者水平升高增高可提示TIA 患者預后不良。但本次研究仍存在部分局限之處，樣本量較少，數據可能存在一定的偏倚，關于miR-450b-5p 在TIA 發生發展中扮演的角色以及其具體的作用機制仍有待于進一步研究。