miRNA-10a、GATA6在肝細胞癌組織中的表達及意義

余袁媛 曾新桃

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌最為常見的類型，是我國惡性腫瘤相關死亡的主要原因［1］。HCC 的發生與長期大量飲酒、丙型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、乙型病毒性肝炎等因素相關，我國HCC 發生的主要原因是乙型病毒性肝炎［2］。現階段臨床對HCC 的發病機制及診療取得了進展，但少數患者術后存在轉移或復發，嚴重影響了患者的預后［3］。因此，尋找新的腫瘤標志物對臨床指導治療、準確評估預后具有重要的價值。微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類非編碼RNA，能與mRNA 結合阻斷蛋白編碼基因的表達［4］。臨床研究發現，微小RNA-10a（microRNA-10a，miRNA-10a）能進入線粒體調控癌基因的表達，與多種惡性腫瘤的關系密切［5］。核轉錄因子GATA6（GATA-binding protein 6，GATA6）是一種轉錄調節因子，有研究發現，GATA6 異常表達于多種腫瘤疾病中，能影響惡性腫瘤的發生和發展［6］。本研究將探討miRNA-10a、核轉錄因子GATA6在HCC 組織中的表達及意義，以期為臨床HCC診療提供參考，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2017年6月至2019年6月92 例經手術切除治療的HCC 患者，術后取癌組織及癌旁組織。納入標準：①滿足《原發性肝癌診療規范》［7］中診斷標準，并經病理學檢查確診；②首次確診；③術前未接受免疫治療或放化療；④本研究經醫院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。排除標準：①繼發性肝細胞癌；②合并自身免疫性疾病、感染性疾病者；③存在其他惡性腫瘤者；④肝癌復發者；⑤腎、心、肺等其他重要臟器嚴重損傷者；⑥臨床病理資料不完整者。92 例HCC 患者中男性63 例，女性29 例；年齡平均（52.61±6.02）歲；TMN 分期：Ⅰ期12 例，Ⅱ期28 例，Ⅲ期52 例；分化程度：低分化43例，中分化28 例，高分化21 例；乙肝40 例，肝硬化45 例；淋巴結轉移44 例；腫瘤直徑＞5 cm 30 例。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與保存

收集HCC 患者癌組織及癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣＞5 cm），經快速液氮冷凍后送至標本庫，于-80℃環境保存備用。

1.2.2 miRNA-10a、核轉錄因子GATA6mRNA檢測

取50 mg 組織標本，進行冰上研磨，并按TRIzol 說明書進行組織RNA 提取，根據逆轉錄試劑盒說明合成cDNA，使用分光光度計鑒定cDNA純度，確保A260/A280 在1.8～2.0，并置于-20℃冰箱儲存。TRIzol 試劑、逆轉錄試劑盒均購自美國Invitrogen 公司，采用RT-PCR 法檢測miRNA-10a、核轉錄因子GATA6 mRNA 水平，取GAPDH 為內參物。miRNA-10a 上游引物序列：5′-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下游引物序列：5′-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3′；GATA6 mRNA 上游引物序列：5′-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3′，下游引物序列：5′-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3′；GAPDH 上游引物序列：5′-CTGCAGCATCTTCTCCTTCC-3′，下游引物序列：5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′。擴增條件如下：95℃5 min；95℃15 s 進行變性，60℃60 s 進行退火，72℃5 min 30 s 進行延伸，此為1 個循環，共進行40 個循環，實時定量PCR 測定，以2-ΔΔCt法計算miRNA-10a、核轉錄因子GATA6mRNA 相對表達量，具體步驟嚴格遵循試劑盒說明書進行。

1.3 隨訪

對患者進行18 個月隨訪，隨訪方式為電話或門診復診，記錄隨訪結果（存活或死亡）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量數據以（）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗；采用Cox 比例風險回歸模型分析影響HCC 患者預后的危險因素。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC 患者癌組織及癌旁組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達水平比較

HCC 患者癌組織miRNA-10a、GATA6mRNA相對表達量高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC 患者癌組織及癌旁組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues and para-cancerous tissues in HCC patients（±s）

表1 HCC 患者癌組織及癌旁組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues and para-cancerous tissues in HCC patients（±s）

組織類型癌組織癌旁組織t 值P 值n 92 92 miRNA-10a 1.97±0.35 0.65±0.13 33.911＜0.001 GATA6 mRNA 3.53±0.71 1.41±0.28 26.643＜0.001

2.2 不同臨床病理特征HCC 患者癌組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達水平比較

HCC 患者癌組織中miRNA-10a、GATA6mRNA 表達水平與TMN 分期、分化程度、乙肝、肝硬化、淋巴結轉移、腫瘤直徑有關（P＜0.05），與年齡、性別無關（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理特征HCC 患者癌組織中miRNA-10a、GATA6 mRNA 表達水平比較［n（%）］Table 2 Comparison on the expression levels of miRNA-10a and GATA6 mRNA in cancer tissues among HCC patients with different clinicopathological characteristics［n（%）］

2.3 影響HCC 患者預后的相關因素分析

隨訪18 個月結果顯示，92 例HCC 患者，失訪2例，存活53 例，死亡37 例，存活率為58.89%。排除2 例失訪患者后采用Cox 比例風險回歸模型進行分析，結果顯示：TMN 分期增高、中高分化、乙肝、肝硬化、淋巴結轉移、腫瘤直徑≥5 cm、miRNA-10a、GATA6mRNA 表達水平過高是影響HCC 患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響HCC 患者預后的危險因素分析Table 3 Risk factors affecting prognosis of HCC patients

3 討論

HCC 早期缺乏典型癥狀，多數患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳治療時機，導致預后較差、生存期短［8］。因此，臨床需要尋找合理的腫瘤標志物評估HCC 復發及轉移風險，進一步為臨床HCC 治療提供依據。

miRNAs 能調控靶基因表達，對細胞生長、分化及凋亡等生理過程產生影響，近年來的研究表明miRNAs 與腫瘤的發生及進展等過程密切相關［9-10］。miRNA-10a 是位于17 號染色體的miRNA，與惡性腫瘤的侵襲及轉移密切相關［11］。國內研究發現，在胰腺癌患者組織中miRNA-10a 表達水平升高，且上調miRNA-10a 表達可以促進胰腺癌細胞增殖及遷移［12］。國外研究發現，miRNA-10a 在子宮頸癌組織中呈高表達，并可以調節靶基因-神經細胞黏附分子，促進宮頸癌浸潤及淋巴細胞轉移，進而影響預后［13-14］。有報道顯示，miRNA-10a 在胃癌中呈高表達，且可以直接靶向MAFK8IP1，調控腫瘤轉移［15］。本研究結果顯示，HCC 患者癌組織中miRNA-10a 表達水平高于癌旁組織，提示miRNA-10a 可能作為癌基因參與了HCC 的發生。有研究發現，miRNA-10a 表達上調可能會使EphA4表達減少，進而在一定程度上促進肝癌細胞發生侵襲及轉移［16］。本研究結果表明miRNA-10a在HCC的進展過程中可能發揮著癌基因作用。本研究結果顯示，隨著TMN 分期的增加，miRNA-10a 表達上調，且存在淋巴結轉移的HCC 患者癌組織中miRNA-10a出現高表達的占比高于無淋巴結轉移者，這進一步證明了miRNA-10a 參與了HCC 的侵襲和轉移。

GATA6 是位于18 號染色體的核轉錄因子，可與半限制轉錄因子通過相互作用來調控機體細胞類型特化，與多種腫瘤的發生及發展密切相關［17］。國外研究發現，GATA6 具有保守、穩定的鋅指結構，對腫瘤細胞增殖有促進作用，對腫瘤細胞凋亡有抑制作用［18］。提示GATA6作為原癌基因在HCC患者癌組織中高度表達，與上述研究結果一致。閆江鶴等［19］認為，癌細胞在GATA6 作用下會釋放大量的細胞黏附分子，細胞黏附分子含量升高會導致癌細胞與內皮細胞緊密黏附，有利于癌細胞穿透細胞外基質層，建立轉移灶。進一步分析結果提示GATA6 參與了HCC 的局部浸潤及遠處轉移，可作為HCC 發生侵襲性生物學行為的標志物。對影響HCC 患者預后的危險因素分析可見，TMN 分期增高、中高分化、乙肝、肝硬化、淋巴結轉移、腫瘤直徑≥5 cm、miRNA-10a、GATA6mRNA 表達水平過高是影響HCC 患者預后的獨立危險因素，進一步提示miRNA-10a、GATA6 表達與HCC 患者臨床預后的關系密切，臨床可以通過檢測miRNA-10a、GATA6 表達情況，評估HCC 患者的預后情況。

綜上所述，miRNA-10a、核轉錄因子GATA6 在HCC 患者癌組織中呈高表達，其表達水平與TMN分期、分化程度、乙肝、肝硬化、淋巴結轉移、腫瘤直徑及預后有關。