二甲雙胍聯合miR-145對胃癌BGC823細胞增殖凋亡及AKT信號通路的影響

田春陽 劉曉政 范軍朝

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼短序列的RNA，多數miRNAs 在胃癌的組織或細胞中異常表達，參與腫瘤細胞的增殖凋亡等生物學過程，調控著胃癌的發生發展［1-2］。近年來有研究指出，miR-145 在胃癌中異常低表達，與胃癌的惡性增殖和轉移關系密切［3-4］，以miR-145 為治療胃癌靶點的研究備受關注。二甲雙胍是臨床上常用的一種口服降糖藥，其在胃癌治療中也表現出良好的抗腫瘤作用［5-6］。有研究指出，miR-145 聯合二甲雙胍具有協同抑制人結腸癌細胞株HCT116增殖的作用［7］。本研究旨在闡明miR-145 聯合二甲雙胍抗胃癌的可行性，并探討其可能的分子機制，以期為胃癌的治療提供新的策略和理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人胃癌細胞株BGC823 購于中國科學院上海細胞庫。RPMI1640 培養基、新生牛血清、Trizol 試劑和Lipofectamine 2000 購于美國Invitrogen 公司。miR-145 mimic、陰性對照NC 和PCR 引物購于上海吉瑪制藥技術有限公司。噻唑藍（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑和二甲基亞楓購于Sigma-Aldrich 公司，逆轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）試劑和細胞裂解液購于北京全式金生物技術有限公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購于Bioworld 公司，細胞周期素D1（Cyclin D1）抗體購于美國Cell Signaling Technology 公司，磷酸化蛋白激酶B（Phosphorylated protein kinase B，p-Akt）抗體、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、辣根過氧化酶標記的羊抗鼠/兔IgG 購于美國Santa Cruz 公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜和增強化學發光（enhancedchemiluminescence，ECL）試劑盒購于美國Millipore 公司，逆轉錄試劑盒、凋亡檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購于美國Thermo 公司。

1.2 主要儀器

HERA cell240 CO2細胞培養箱購于德國Heraeus 公司，Meddel680 酶標儀、Western blot 轉膜系統購于美國BIO-RAD 公司，Moflo XDP 流式細胞儀購于美國Beckmancoulter 公司，Mastercycler pro梯度PCR 儀購于美國Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與轉染

用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的RPMI1640 培養基在CO2體積分數為5%、溫度為37℃和濕度飽和的細胞培養箱中培養BGC823 細胞。取對數生長期的BGC823 細胞，以每孔106個細胞種植到6 孔細胞板上，于培養箱內常規培養過夜。待細胞匯合度超過70%時進行轉染。實驗分為對照組（未轉染）、NC 組（轉染陰性對照NC）和miR-145 組（轉染miR-145 mimic），參照轉染試劑Lipofectamine 2000 使用說明書步驟根據上述分組進行轉染。孵育6 h 后，更換含血清的培養基繼續培養。48 h 后，采用RT-PCR 檢測各組細胞中miR-145 的表達水平，以評價其轉染效果。

1.3.2 RT-PCR 檢測

采用Trizol 法提取對照組、NC 組和miR-145組細胞的總RNA，并以紫外分光光度計對總RNA進行濃度和純度的定量。以RNA 為模板，參照逆轉錄試劑盒步驟合成cDNA。再跟據上海吉瑪公司合成的miR-145 引物（上游5′ATTATATTGTCCAGTTTTCCCAGG-3′，下游5′-AAAGGTT-GTTCTCCACTCTCTCTC-3′）及內參U6 引物（上游5′-ATTGGAACGATA-CAGAAGATT-3′和下游5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′），以50 μL 反應體系（上下游引物各1 μL、dNTP Mix 1 μL、Taq DNA 聚合酶1 μL、cDNA 模板2 μL 和ddH2O 44 μL）按照反應條件（94 ℃預變性3 min；94 ℃變性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，共循環35 次；最后72℃后延伸6 min）進行PCR 擴增，取5 μL 擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，采用2-△△Ct法計算各組BGC823 細胞中miR-145 的表達水平。

1.3.3 MTT 法檢測

取對數生長期BGC823 細胞，以每孔5×103個細胞種植到96 孔細胞板上，置于細胞培養箱內培養24 h。設置空白對照組（0 mmol/L 二甲雙胍）和二甲雙胍處理組（加入2.5、5、10、20 和40 mmol/L二甲雙胍），并設置無細胞的調零孔。根據實驗分組加入二甲雙胍分別作用24、48 和72 h。其中，每個濃度設置3 個復孔。參照文獻［8］上酶標儀檢測各組細胞在570 nm 波長處的光密度值（optical density，OD 值），根據公式計算各組細胞的存活率。細胞存活率（%）=（二甲雙胍組OD 值-調零組OD 值）/（空白對照組OD 值-調零組OD 值）×100%。每組實驗重復檢測3 次。

1.3.4 流式細胞儀檢測

取對數生長期BGC823 細胞，以每孔3×104個細胞種植于6 孔細胞板上，孵育24 h 后，將其隨機分為未處理組（不做處理）、二甲雙胍組（加入10 mmol/l 二甲雙胍）、miR-145 組（轉染miR-145 mimic）和二甲雙胍+miR-145 組（轉染miR-145 mimic后加入10 mmol/l 二甲雙胍），根據實驗分組對BGC823 細胞進行轉染和藥物處理后，于細胞培養箱內培養72 h，參照凋亡檢測試劑盒說明書步驟檢測各組細胞的凋亡率。參照1.2.3 中的方法檢測各組細胞的存活率。每組實驗重復檢測3 次。

1.3.5 Western blot 檢測

收集未處理組、二甲雙胍組、miR-145 組和二甲雙胍+miR-145 組細胞，于冰上加入細胞裂解液提取總蛋白，所提總蛋白經BCA 法檢測定量后，與上樣緩沖液等量混合，上SDS-PAGE 凝膠電泳分離，然而采用轉膜儀將其轉至PVDF 膜上，以封閉液（含50 g/l 脫脂奶粉）處理2 h 后，分別依次加入1∶500 倍稀釋的一抗于4℃反應24 h、1∶2 000 倍稀釋的辣根過氧化酶標記的二抗于37 ℃反應1 h，抗原抗體充分反應后，以ECL 化學發光劑顯色，成像儀成像，以GAPDH 為內參，Image J 軟件分析。

1.4 數據分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，計數資料（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染后胃癌BGC823 細胞中miR-145 的表達

NC 組細胞中miR-145 表達與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05），但miR-145 組中miR-145表達較對照組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 轉染后各組胃癌BGC823細胞中miR-145的表達（±s）Table 1 The relative expression of miR-145 in gastric cancer BGC823 cells after transfection（±s）

表1 轉染后各組胃癌BGC823細胞中miR-145的表達（±s）Table 1 The relative expression of miR-145 in gastric cancer BGC823 cells after transfection（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05。

組別對照組NC 組miR-145 組F 值P 值miR-145 1.00 0.96±0.07 3.65±0.34a 177.513 0.000

2.2 二甲雙胍對胃癌BGC823 細胞增殖的影響

以不同濃度二甲雙胍處理胃癌BGC823 細胞24、48 和72 h 后，MTT 法篩選出接近半數抑制濃度的二甲雙胍。與空白對照組（0 mmol/L）相比，二甲雙胍處理組中細胞的存活率均顯著降低（P＜0.05），且呈時間-劑量依賴性。在72 h 作用時間下，10 mmol/L 二甲雙胍對BGC823 細胞的抑制作用接近半數抑制濃度，故后期選用10 mmol/L 濃度的二甲雙胍作用72 h 進行實驗。見表2。

表2 二甲雙胍對胃癌BGC823 細胞存活率的影響（±s）Table 2 Effect of metformin on survival rate of gastric cancer BGC823 cells（±s）

表2 二甲雙胍對胃癌BGC823 細胞存活率的影響（±s）Table 2 Effect of metformin on survival rate of gastric cancer BGC823 cells（±s）

注：與0 mmol/L 相比，aP＜0.05。

72 h 100 85.07±5.64a 67.65±4.59a 50.28±3.35a 45.01±2.94a 40.48±2.15a 132.707 0.000濃度（mmol/L）0 2.5 5 10 20 40 F 值P 值24 h 100 95.12±2.03a 88.52±2.15a 73.73±2.01a 68.42±1.33a 57.67±1.05a 315.332 0.000 48 h 100 91.23±5.78a 76.36±4.59a 65.49±3.67a 53.38±2.89a 46.80±2.36a 96.595 0.000

2.3 二甲雙胍單獨或聯合miR-145 對胃癌BGC823 細胞增殖凋亡的影響

與未處理組相比，二甲雙胍組、miR-145 組和二甲雙胍+miR-145 組細胞的存活率顯著降低，凋亡率顯著升高，且二甲雙胍+miR-145 組的作用強度明顯大于二甲雙胍組或miR-145 組（P＜0.05）。見圖1和表3。

表3 各組BGC823 細胞存活率和凋亡率的比較（±s）Table 3 Comparison of BGC823 cell survival rate and apoptosis rate in each group（±s）

表3 各組BGC823 細胞存活率和凋亡率的比較（±s）Table 3 Comparison of BGC823 cell survival rate and apoptosis rate in each group（±s）

注：與未處理組相比，aP＜0.05；與二甲雙胍組相比，bP＜0.05。

組別未處理組二甲雙胍組miR-145 組二甲雙胍+miR-145 組F 值P 值細胞存活率（%）100 50.13±5.12a 67.85±5.36a 37.25±3.34ab 402.777 0.000細胞凋亡率（%）3.62±0.55 22.56±2.18a 13.64±1.12a 36.74±2.25ab 625.312 0.000

圖1 流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡Figure 1 The apoptosis of cells in each group was detected by flow cytometry

2.4 二甲雙胍單獨或聯合miR-145 對胃癌BGC823細胞中CyclinD1、Bcl-2 和p-AKT 蛋白表達的影響

與未處理組相比，二甲雙胍組、miR-145 組和二甲雙胍+miR-145 組中三種蛋白的表達水平均顯著降低，且二甲雙胍+miR-145 組顯著低于二甲雙胍組或miR-145 組（P＜0.05）。見表4。

表4 各組BGC823 細胞中CyclinD1、Bcl-2 和p-AKT 蛋白的相對表達量Table 4 The relative expression of CyclinD1，Bcl-2 and p-AKT proteins in BGC823 cells of each group

3 討論

腫瘤的發生發展是一個復雜的過程，miRNA在其中發揮著原癌基因或抑癌基因的調控作用。miR-145 是一種高度保守的miRNA，定位于5q32染色體上，可通過多種途徑調控細胞的增殖和凋亡過程，參與腫瘤的發生與演變。miR-145 在腎細胞癌組織中的表達顯著下調，與腫瘤的分期、腫瘤大小等密切相關［9］；上調肝癌或宮頸癌細胞中miR-145 表達可通過抑制癌細胞的增殖、侵襲和遷移并誘導細胞凋亡［8，10］。另外，miR-145 還可通過抑制MRP1 表達增強乳腺癌對化療藥物阿霉素的敏感性［11］?？梢姡琺iR-145 與多種腫瘤的發生發展密切相關，其有望成為腫瘤治療的潛在靶點。二甲雙胍是常用的降糖藥，同時其還對多種腫瘤表現出較好的抗腫瘤作用。例如，二甲雙胍通過降低H3K27 三甲基化抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，促進癌細胞凋亡［12］；同時，二甲雙胍還可以通過調控miRNAs 表達參與抑制胰腺癌細胞增殖［13］。已有學者指出，miR-145 在胃癌組織和患者外周血中低表達，參與腫瘤細胞的惡性增殖、凋亡和轉移過程［4，6］；二甲雙胍能夠抑制胃癌的生長［14-15］。本研究結果與王鐘林［8］等所得出的miR-145 聯合二甲雙胍具有協同抑制結腸癌HTC116 細胞增殖的結果相吻合，同時也與朱明霞等［16］研究指出的上調miR-145 表達可增強順鉑誘導胃癌細胞凋亡機制相吻合。這提示，上調miR-145 表達和二甲雙胍聯合具有協調抑制胃癌細胞生長的作用。

CyclinD1 是細胞周期G1 期進入S 期的正向調控因子，也是一種重要的原癌基因，其過度表達可引起細胞增殖失控，促進腫瘤的發生；Bcl-2 是公認的細胞凋亡抑制因子，可通過介導多種信號通路參與細胞的凋亡過程；AKT 是PI3K/AKT 信號通路的關鍵分子，p-AKT 是AKT 的活化狀態，活化的AKT 可調控下游相關基因如CyclinD1、Bcl-2 的表達抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，參與腫瘤的發生發展；CyclinD1、Bcl-2 和p-AKT 均在胃癌的發生發展過程中發揮著重要作用［17］。本研究結果發現，二甲雙胍單獨或與miR-145 mimics 聯合均能夠降低胃癌BGC823 細胞中CyclinD1、Bcl-2和p-AKT 蛋白的表達水平，且二甲雙胍聯合miR-145 mimics 的作用明顯大于二甲雙胍單獨作用。已研究證實，在膠質母細胞瘤中miR-145 的丟失可導致細胞增殖分子Cyclin D1 表達過多［18］；結果提示，miR-145 可通過抑制AKT 信號通路的活化增強二甲雙胍抗胃癌的作用。

總之，二甲雙胍聯合miR-145 具有更強的抗胃癌作用，其可能通過抑制AKT 信號通路協調抑制胃癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。本研究僅從體外細胞水平上闡述了二甲雙胍聯合miR-145抗胃癌的作用，后續還需從體內動物實驗加以驗證。