MAIT細胞及其分泌因子表達與肺結核病情嚴重程度的關系

李福利 劉捷凌 冷霞 孫曉柯 阮祥林

肺結核是結核分枝桿菌感染肺部引起的呼吸系統疾病，屬于慢性傳染病［1］。人體感染結核分枝桿菌不一定發病，90%以上的人群感染后可長期處于潛伏狀態，但當機體抵抗力降低或細胞介導的變態反應增高時，會引起臨床發?。?］。因此，肺結核的發生發展不僅和結核分枝桿菌的數量和毒力有關，還與宿主自身免疫功能密切相關。現代免疫學研究也證實，復雜的細胞免疫調節系統與肺結核的病情發展有關［3］。粘膜相關恒定T 細胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT）是體內高度保守的天然免疫T 細胞，在啟動自身免疫活化，分泌效應分子對抗微生物感染中有重要的作用［4-5］。越來越多的證據表明，MAIT 細胞介導免疫反應在多種疾病的發生發展中有重要作用［6-7］。本研究將通過檢測肺結核患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平，分析外周血MAIT 細胞功能與患者病情嚴重程度的關系，以期進一步明確MAIT 細胞與肺結核疾病進展的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月至2019年3月入院治療的142 例肺結核患者作為肺結核組。納入標準：①肺結核的診斷標準參考《肺結核診斷的治療指南》［8］；②年齡＞18 歲；③患者及家屬自愿參與，且簽署知情同意書。排除標準：①抗結核治療應用免疫調節劑；②合并惡性腫瘤、自身免疫系統疾病等；③嚴重心、肝、腎功能不全；④孕婦和哺乳期女性；⑤存在認知障礙和溝通障礙。同時選取45 例健康志愿者作為對照組。兩組性別比例、年齡、體質指數比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。本研究已通過醫院倫理委員會審批。

表1 兩組患者基線資料比較（±s）Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups（±s）

表1 兩組患者基線資料比較（±s）Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups（±s）

組別肺結核組對照組t/χ2值P 值n 142 45性別（男/女）82/60 24/21 0.271 0.603年齡（歲）47.29±7.21 46.83±8.16 0.361 0.718體質指數（kg/m2）23.59±2.15 23.82±2.26 0.618 0.538

1.2 患者分組

肺結核患者入院后1 周內完成胸片或胸部CT檢查，并了解其相關病例資料。根據患者肺結核的不同類型，分為初治組（n=68）和復治組（n=74）。根據影像學表現分組：①肺部病灶范圍分組：A 組（1～2 個肺野）（n=62）、B 組（3～4 個肺野）（n=45）和C 組（5～6 個肺野）（n=35）；②肺部是否有空洞分組：空洞組（n=59）和無空洞組（n=83）。

1.3 檢測方法

采集受試者空腹肘部靜脈血5 mL，抗凝處理后，加入淋巴細胞分離液分離單個核細胞，分別加入CD3、CD8、CD161 抗體，常溫下避光孵育30 min，清洗后上流式細胞儀（美國Beckman Coulter 公司）進行檢測，其中CD8+CD161+標記細胞即為MAIT。再分選上述MAIT 細胞（密度2×105個/mL），分別加入干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、顆粒酶B（Granzyme B）及白細胞介素17（interleukin-17，IL-17）抗體，檢測MAIT 細胞中IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及IL-17 的表達，流式抗體均購自美國Santa Cruz 公司。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行數據分析，服從正態分布的計量資料以（）表示，方差齊性兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩分析采用SNK-q法；計數資料以n（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較

肺結核組患者外周血MAIT 細胞比例、分泌IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 的MAIT 細胞比例顯著低于對照組，分泌IL-17 的MAIT 細胞比例顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較（±s）Table 2 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood between 2 groups（±s）

表2 兩組外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較（±s）Table 2 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood between 2 groups（±s）

組別肺結核組對照組t 值P 值n 142 45 MAIT 細胞（%）3.37±0.88 5.93±1.42 14.468＜0.001 IFN-γ（%）7.84±2.07 12.61±3.21 11.662＜0.001 TNF-α（%）3.45±1.10 5.37±1.62 9.025＜0.001 Granzyme B（%）1.43±0.42 2.37±0.65 11.337＜0.001 IL-17（%）5.24±1.56 3.73±1.14 6.000＜0.001

2.2 不同肺結核類型患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較

初治組和復治組患者外周血MAIT 細胞比例及其分泌細胞因子水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同肺結核類型患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較（±s）Table 3 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different types of tuberculosis（±s）

表3 不同肺結核類型患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較（±s）Table 3 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different types of tuberculosis（±s）

組別初治組復治組t 值P 值n 68 74 MAIT 細胞（%）3.46±0.92 3.21±0.80 1.731 0.086 IFN-γ（%）7.97±2.13 7.62±1.95 1.022 0.308 TNF-α（%）3.62±1.28 3.31±1.02 1.602 0.111 Granzyme B（%）1.49±0.48 1.38±0.35 1.569 0.119 IL-17（%）5.13±1.66 5.47±1.51 1.278 0.203

2.3 不同病灶范圍患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較

不同肺部病灶范圍患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較差異有統計學意義（P＜0.05），其中A 組MAIT 細胞及分泌IFN-γ、TNF-α 及Granzyme B 水平均高于B 組和C 組，分泌IL-17 水平低于B組和C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同病灶范圍患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較（±s）Table 4 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different ranges of lesions（±s）

表4 不同病灶范圍患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較（±s）Table 4 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different ranges of lesions（±s）

注：與A 組比較，aP＜0.05；與B 組比較，bP＜0.05。

IL-17（%）4.65±1.42 5.53±1.78a 6.11±1.84a 9.485＜0.001組別A 組B 組C 組F 值P 值n 62 45 35 MAIT 細胞（%）3.81±1.02 3.29±0.75a 2.63±0.70ab 20.824＜0.001 IFN-γ（%）8.43±2.51 7.19±1.98a 6.32±1.82a 12.138＜0.001 TNF-α（%）4.37±1.35 3.16±1.02a 2.73±0.84a 27.624＜0.001 Granzyme B（%）1.73±0.52 1.32±0.41a 1.18±0.33a 20.242＜0.001

2.4 不同空洞表現患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較

空洞組和無空洞組患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 不同空洞表現患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較（±s）Table 5 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different cavity manifestations（±s）

表5 不同空洞表現患者外周血MAIT 細胞及其分泌細胞因子水平比較（±s）Table 5 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different cavity manifestations（±s）

組別空洞組無空洞組t 值P 值n 59 83 MAIT 細胞（%）3.27±0.79 3.52±0.92 1.690 0.093 IFN-γ（%）7.71±1.84 8.05±2.26 0.952 0.342 TNF-α（%）3.31±0.95 3.62±1.18 1.669 0.097 Granzyme B（%）1.41±0.48 1.45±0.40 0.540 0.590 IL-17（%）5.53±1.43 5.11±1.72 1.536 0.127

3 討論

1993年，MAIT 細胞首次在腸黏膜淋巴組織中被發現，其是一類表達半恒定T 細胞受體的T 淋巴細胞［9］。不同于傳統T 淋巴細胞可表達多種T 細胞受體識別多種抗原，MAIT 細胞僅能限制性識別主要組織相容性復合體1b 分子，呈現出高度保守性［10］。MAIT 細胞起源于造血干細胞，在人體血液和肝臟內數量豐富，可參與抵抗病原體、腸道免疫、維持上皮細胞穩態等過程。

近年來研究顯示，MAIT 細胞在宿主防御感染性病原體的免疫反應中有重要的調控作用，可能是天然的、抗感染、抗炎因素［11］。相關臨床研究結果也顯示，聚集于腸黏膜中的MAIT 細胞在腸炎疾病中具有保護性作用［12］。病原體入侵后，MAIT 細胞可以識別來源于細菌和酵母菌的抗原，活化后的MAIT 細胞可聚集于感染灶，可迅速分泌細胞因子，主要是IFN-γ 和TNF-α，殺傷受損的細胞，并調節樹突狀細胞等免疫細胞功能。MAIT 細胞是一種具有同源表型的細胞亞型，占人類外周血T細胞的1%～10%［13］。本研究結果這與既往研究報道感染性疾病患者外周血MAIT 細胞的數量減少相符［14］。但MAIT 細胞在肺結核患者肺組織中的表達情況還不清楚，后期將努力收集其肺組織樣本，觀察MAIT 細胞在感染部位免疫應答情況。

目前，MAIT 細胞對于銅綠假單胞菌、分支桿菌屬的抗菌作用已在相關鼠類模型中明確，上述感染模型中MAIT 細胞數量減少，而細菌負荷增加［15］，但MAIT 細胞發揮抗菌活性的具體機制還不清楚。活化的MAIT 細胞可迅速分泌細胞因子及細胞毒性產物，包括IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及IL-17等。通過流式細胞術發現，肺結核患者外周血MAIT 細胞分泌細胞因子功能也發生改變，分泌IFN-γ、TNF-α 及Granzyme B 等細胞因子能力減弱，而分泌IL-17 因子能力增強，這與報道指出MAIT 細胞在不同疾病中呈現的功能不同相符［16］。B?ttcher 等［17］研究報道，MAIT 細胞在疾病狀態中分泌的細胞因子由Th1 型轉向Th17 型，與本文結果相符。本研究分析結果進一步說明MAIT 細胞及其功能與肺結核的進展密切相關。但本研究納入病例數較少，后續將擴大樣本量進行驗證。

綜上所述，肺結核患者外周血MAIT 細胞功能存在明顯缺陷，病灶范圍較廣的患者MAIT 細胞功能缺陷更明顯。但患者體內免疫調節網絡是復雜、多面的，MAIT 細胞及其分泌因子在不同疾病狀態下所起的作用也不盡相同。MAIT 細胞在肺結核中的作用機制尚未徹底明確，仍需進一步研究闡明其免疫機制。MAIT 細胞功能應用于肺結核病情判斷和相關治療將是本課題未來的研究方向。