FSH-PI3K/AKT/NF-κB蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達及作用機制

路曉琳

卵巢癌是女性常見惡性腫瘤，據統計，上皮性卵巢癌5年生存率僅為30%～40%，死亡率居于婦科惡性腫瘤首位［1-2］。激素環境與卵巢癌發生發展密切相關，過量卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，FSH）刺激可能是卵巢癌發生的重要危險因素［3］。有文獻證實，FSH 通過作用于細胞表面FSH 受體（FSHR）促使細胞內相關信號通路被激活，從而在卵巢癌中發揮作用，但具體作用機制仍有待探討［4］。研究顯示，磷脂酞肌醇3 激酶/蛋白激酶B（Phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）通路在惡性腫瘤發生發展中具有重要作用［5］。核轉錄因子κB（Nuclear transcription factor κB，NF-κB）屬于信號通路的中樞，與細胞增殖、凋亡聯系緊密［6］。因此，本研究嘗試探究FSHPI3K/AKT 信號通路-NF-κB 蛋白對上皮性卵巢癌發生發展的影響，旨在為臨床制定治療方案提供依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選取邯鄲市中心醫院2015年7月至2016年10月手術切除的上皮性卵巢癌組織（32 例）、卵巢交界性腫瘤組織（32 例）、卵巢良性腫瘤組織（32例）、正常卵巢組織（32 例）作為研究資料來源，采用搔刮法對人卵巢表面上皮細胞進行原代培養，SKOV-3 細胞株為北京大學人民醫院婦科實驗室提供；3AO 細胞株為河北醫科大學第四醫院實驗中心提供，均用常規RPMI-1640 培養基培養；注射用重組人卵泡刺激素來自瑞士Laboratoires Serono SA 公司；LY294002 來自美國Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法

將4 種卵巢標本組織芯片進行4 μm 切片，敷貼在處理好的載玻片，置入烤箱中加熱（0.5～1 h），采用免疫組化法檢測4 種卵巢組織中表達FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白的細胞比例。判定標準［7］：陽性細胞＞50%為3 分，21%～50%為2 分，10%～20%為1 分，＜10%為0 分；細胞染色強度：黃褐色為3 分；黃棕色為2 分；淺黃色為1 分，無黃色為0 分。細胞染色強度與陽性細胞比例積分的乘積為最終積分，＜3 分判定為陰性，≥3 分判定為陽性。

1.2.2 四甲基偶氮唑藍（Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法［8］

取對數生長期SKOV-3、3AO 細胞經胰酶消化后，調整細胞濃度為1×105/mL，每孔100 μL 培養于96 孔培養板中，培養6～8 h，待細胞貼壁后，調整培養液，分為只加培養基不加細胞的空白對照組、不含藥培養基的對照組、FSH 單獨處理的FSH 組、LY294002 單獨處理的LY 組及LY294002 作用0.5 h 后聯合FSH 的FSH/LY 組，每組設5 個復孔，重復3 次。分別培養12、24、48、72 h 后，吸出含藥培養基，采用MTT 法檢測藥物對SKOV-3、3AO 細胞生長促進作用及其與時間和濃度的關系。細胞生長增殖率=（A 加藥-A 空白）/（A 對照-A 空白）×100%。

1.2.3 Western blot 蛋白印跡法

待上皮性卵巢癌細胞SKOV-3、3AO 經40 mIU/ml FSH（FSH 組）、10 μmol/L LY294002（LY組）、加入LY294002 0.5 h 后聯合FSH（FSH/LY 組）處理，并設對照組，分別于48 和24 h 后倒掉培養液，制作離心上清液，置于-70℃條件下保存，進行SDSPAGE 電泳、轉膜、封閉、加一抗、二抗、洗膜、化學發光、顯影、定影、凝膠圖像分析，觀察FSH 和LY294002 分別及序貫聯合作用于SKOV-3、3AO 細胞前后FSHR、AKT1/2、p-AKT、NF-κB 蛋白的表達。

1.2.4 Transwell 小室侵襲實驗

調整細胞濃度為1×105/mL，每孔上層小室中加200 μL 細胞懸液，24 孔板槽中加入500 μL 含10%胎牛血清的培養基。待細胞貼壁后，用FSH 40 mIU/mL 和LY294002 10 μmol/L 分別及序貫聯合作用于細胞，48 h 后結晶紫染色，顯微鏡下觀察上層小室底部穿過的細胞情況并計數。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 22.0 進行統計學分析，計數資料采用n（%）表示，行χ2檢驗對比，計量資料以（）描述，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩組間比較采用LSD-t 檢驗，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，相關性采用Spearman 相關性模型分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同卵巢組織FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白陽性表達細胞比率

上皮性卵巢癌組織FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白陽性表達率：卵巢交界性腫瘤組織＞卵巢良性腫瘤組織＞正常卵巢組織（P＜0.05），卵巢交界性腫瘤組織、卵巢良性組織、正常卵巢組織比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同卵巢組織中FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白陽性表達率比較［n（%）］Table 1 FSHR，p-Akt，NF in different ovarian tissues-κ Comparison of the positive expression rate of B proteinn［n（%）］

2.2 上皮性卵巢癌組織中FSHR、p-AKT、NF-κB蛋白表達相關性

Spearman 相關性分析，上皮性卵巢癌組織中FSHR 與p-AKT、NF-κB 蛋白表達呈正相關（r=0.671、0.759，P均＜0.001），p-AKT 與NF-κB 蛋白表達呈正相關（r=0.718，P＜0.05）。

2.3 FSH 對SKOV-3、3AO 細胞生長促進作用及其與時間和濃度的關系

SKOV-3 細胞于FSH 濃度40 mIU/mL 作用48 h 時細胞增殖率最大。不同濃度比較差異有統計學意義（P＜0.05）；不同時間點比較差異無統計學意義（P＞0.05）；3AO 細胞于FSH 濃度40 mIU/mL作用24 h 時細胞的增殖率最大，最大增殖率為（173.92±1.92）%。不同濃度、不同時間點比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 FSH 對SKOV-3、3AO 細胞生長促進作用及其與時間和濃度的關系（±s）Table 2 growth promoting effect of FSH on SKOV-3 and 3AO cells and its relationship with time and concentration（±s）

表2 FSH 對SKOV-3、3AO 細胞生長促進作用及其與時間和濃度的關系（±s）Table 2 growth promoting effect of FSH on SKOV-3 and 3AO cells and its relationship with time and concentration（±s）

注：a vs b vs c vs d vs e P＜0.05；A vs B vs C vs D P＞0.05。

細胞SKOV-3 細胞3AO 細胞FSH（mIU/mL）10a 20b 40c 80d 160e F 值P 值10a 20b 40c 80d 160e F 值P 值12 hA 137.26±0.71 141.02±1.25 143.94±1.00 139.71±0.75 141.65±1.18 193.687＜0.001 106.13±4.12 113.07±2.62 117.45±1.04 114.23±4.36 113.15±1.36 59.722＜0.001 24 hB 145.57±1.06 148.18±0.69 151.82±0.91 143.39±1.03 142.14±1.56 407.135＜0.001 114.11±2.05 139.93±5.90 173.92±1.92 172.15±3.14 154.14±2.54 1671.452＜0.001 48 hC 147.45±0.84 153.17±0.95 166.92±1.24 163.26±0.62 161.05±0.87 2337.144＜0.001 109.72±2.22 127.98±3.05 167.91±3.24 158.38±2.34 140.05±1.53 2673.086＜0.001 72 hD 137.60±2.24 144.58±0.75 151.13±1.32 137.48±0.93 131.79±1.05 960.340＜0.001 109.34±6.52 118.17±3.33 142.04±5.36 130.00±2.10 122.09±3.01 256.143＜0.001

2.4 FSH、LY294002 及聯合對SKOV-3、3AO 細胞FSHR、p-AKT、AKT1/2、NF-κB 表達的影響

SKOV-3 細胞中，與對照組相比，FSH 組p-AKT 蛋白表達增加，LY294002 組、FSH/LY294002組p-AKT 蛋白表達減少（P＜0.05）；FSH 組NF-κB蛋白表達高于LY294002 組（P＜0.05）；3AO 細胞中，LY294002 組、FSH/LY294002 組p-AKT 蛋白表達少于對照組（P＜0.05），FSH 組p-AKT 蛋白表達高于對照組、LY294002 組、FSH/LY294002 組（P＜0.05）；FSH 組胞核中NF-κB 蛋白表達高于對照組、LY294002 組、FSH/LY294002 組（P＜0.05）；LY294002 組、FSH/LY294002 組少于對照組，但無統計學差異（P＞0.05）；4 組SKOV-3、3AO 細胞AKT1/2 蛋白表達無明顯差異（P＞0.05）。見表3。

表3 FSH、LY294002 及聯合對SKOV-3、3AO 細胞FSHR、p-AKT、AKT1/2、NF-κB 表達的影響Table 3 Effects of FSH，LY294002 and their combination on FSHR，p-Akt，AKT1/2 and NF in SKOV-3 and 3AO cells-κ The influence of B expression

2.5 FSH、FSH/LY、LY 對SKOV-3、3AO 細胞的侵襲性

對照組、FSH 組、FSH/LY294002 組、LY294002組SKOV-3 細胞穿過基質膜平均細胞數分別為（26±6）、（118±19）、（38±7）、（18±5）個/高倍鏡（×200）；3AO 細胞穿過基質膜平均細胞數分別為（19±4）、（134±20）、（58±11）、（12±3）個/高倍鏡（×200）。對照組、LY294002 組、FSH/LY294002 組兩種細胞穿過小室的細胞數少于FSH 組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 FSH、FSH/LY、LY 對SKOV-3、3AO 細胞的侵襲性Figure 1 Invasiveness of FSH，FSH /ly and ly on SKOV-3 and 3AO cells

3 討論

國內卵巢癌中80%～90%為上皮性卵巢癌，普遍認為與遺傳、環境、內分泌等因素有關［9］。近年來，隨著分子生物學在惡性腫瘤發病機制中的研究不斷進步，細胞因子及相關信號通路與惡性腫瘤發生發展的關系為探索腫瘤發生、增殖、侵襲提供了新思路、新途徑。

FSH 是腺垂體分泌的糖蛋白激素，主要作用是加速竇前卵泡、竇狀卵泡顆粒細胞增殖分化，激活顆粒細胞芳香化酶促進雌二醇等物質合成、分泌，在女性內分泌和生殖功能中具有重要作用［10］。相關研究表明，FSH 與卵巢癌發生發展有關，且在卵巢癌組織表面上皮有FSHR 的表達，說明FSH 的確參與卵巢癌發生發展過程［11］。本研究結果顯示，SKOV-3 細胞于FSH 濃度40 mIU/mL 作用48 h 時細胞增殖率最大，具有濃度依賴性，3AO細胞于FSH 濃度40 mIU/mL 作用24 h 時細胞的增殖率最大，具有時間-濃度依賴性，對照組、LY294002 組、FSH/LY294002 組兩種細胞穿過小室的細胞數少于FSH 組，與閆曉楠等［12］研究報道結果一致，說明FSH 能夠促進上皮性卵巢癌細胞株SKOV-3、3AO 生長、增殖、侵襲的作用。本研究還顯示，上皮性卵巢癌組織FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白陽性表達率高于卵巢交界性腫瘤組織、卵巢良性腫瘤組織、正常卵巢組織，且上皮性卵巢癌組織中FSHR、p-AKT、NF-κB 蛋白之間呈正相關，提示FSH 在上皮性卵巢癌發生發展中的作用可能與p-AKT、NF-κB 蛋白有關。PI3K/Akt 信號通路是一種以促增殖、抗凋亡為主要作用的信號傳導通路，其中PI3K 屬于磷脂酰肌醇依賴激酶家族成員，在調節細胞骨架構筑、細胞增殖、分化過程中發揮重要作用，Akt 屬于該通路最主要的靶酶，活化形式為p-Akt，可抑制細胞凋亡［13］。已有報道證實，NF-κB蛋白作為PI3K/Akt 信號通路的下游分子，是AKT抗凋亡信號的靶點，可導致腫瘤細胞不能及時凋亡，促使腫瘤細胞增殖，加速惡性腫瘤發生［14］。

本研究表明，SKOV-3、3AO 細胞中，與對照組相比，FSH 組p-AKT 蛋白、胞核中NF-κB 蛋白表達增加，LY294002 組、FSH/LY294002 組p-AKT 蛋白表達減少，胞核中NF-κB 蛋白略有減少，說明FSH 可能是經由PI3K/Akt 通路上調卵巢癌細胞株SKOV-3、3AO 中NF-κB 的表達，促進腫瘤細胞增殖、侵襲，在PI3K 抑制劑LY294002 的特異性抑制作用下，p-AKT蛋白、胞核中NF-κB 蛋白呈下調趨勢。分析原因，可能是由于FSH 通過結合細胞膜上的FSHR，激活PI3K，促使Akt 磷酸化，從而導致PI3K/Akt 信號通路異常活化，并通過降解作用促使NF-κB 從復合物中解離，轉位至細胞核中，引發其轉錄活性，進而加快細胞增殖、侵襲，經LY294002 處理后FSH 作用被逆轉，對PI3K/Akt 信號通路異常活化產生抑制作用，阻滯NF-κB 核移位，最終下調卵巢癌細胞增殖、侵襲能力［15］。因此，FSH-PI3K/AKT 信號通路-NF-κB 蛋白有望成為臨床治療上皮性卵巢癌的新靶點。

綜上可知，FSH 可能經由PI3K/Akt 通路上調NF-κB 的表達，促進上皮性卵巢癌腫瘤細胞增殖、侵襲。