甘草甜素通過調控COX-2/NF-kB通路治療牙周炎的研究

張娜 侯鑫 張文 時伯紅

牙周炎是導致牙齒缺失的主要因素，其特征表現為牙周組織的炎性破壞［1-3］。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）是導致牙周炎的主要病原體［4］，其內毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是主要的毒力因子，可誘導人牙齦成纖維細胞NF-κB 活化和炎癥介質釋放白細胞介素6（Interleukin 6，IL-6）和白細胞介素8（Interleukin 8，IL-8）等炎性細胞因子，誘導牙周組織損傷［5］。環氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）作為將花生四烯酸轉化為前列腺素（Prostaglandin E2，PGE2）的關鍵酶，能誘導生成大量的PGs，在炎癥反應中發揮重要作用［6］。而抑制COX-2 的表達可減少骨吸收［7］表明COX-2 在牙周損傷中發揮重要作用。甘草甜素是從甘草中分離出來三萜類成分，又稱甘草酸，通過分解為甘草次酸及葡萄糖醛酸發揮作用，主要表現為抗炎、抗變態反應和免疫調節。其中抗炎是甘草酸類最主要的藥理作用［8-9］。本實驗擬通過檢測甘草甜素對LPS 刺激的人牙齦成纖維細胞（HGFs）的抗炎作用及其分子機制，探討其在牙周炎治療中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

取于2017年1月至2月山東大學口腔醫院就診需拔除埋伏阻生齒的健康志愿者6 名（16～20歲，3 名男性和3 名女性；平均年齡18 歲），收集其術中切除的少量牙齦組織，研究經志愿者知情同意，本實驗經院倫理委員會批準同意。

1.2 試劑與儀器

甘草甜素（純度＞98%）（國家藥品和生物制品控制研究所），牙齦卟啉單胞菌脂多糖（San Diego公司，美國），牙齦卟啉單胞菌脂多糖（Invitrogen公司，美國），細胞增殖試劑盒（MTT）（上海羅氏制藥有限公司），IL-6 ELISA 試劑盒（eBioscience公司，美國），COX-2，β-actin，p-p65 等蛋白一抗抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 人牙齦成纖維細胞的分離培養及細胞活性的測定

將牙齦組織塊放入預先準備好裝有DMEM 培養基（含10%胎牛血清）的無菌瓶中。通過組織塊法培養的人牙齦成纖維細胞，經傳代、分離、純化至第四代，得到純度高、活性好的HGFs。將牙齦成纖維細胞與不同濃度梯度的甘草甜素劑量為30、60、120、240 μg/mL，共培養48 h，次日鏡下觀察可見細胞已經貼壁。按實驗分組依次添加2×甘草甜素100 μL、2×牙齦卟啉單胞菌脂多糖100 μL。輕輕搖晃96 孔細胞培養板，使培養基混合巧勻，放入細胞培養箱；共培養后48 h 后取出，吸盡每孔內的培養基，加入MTT 溶液，每孔30 μL，再次放入細胞培養箱中解育4 h；將DMSO 中溶液注入到孔板中，每孔150 μL，放入細胞培養箱中孵育過夜；次日，取出96孔細胞培養板，肉眼觀察可見紫色甲瓚晶體已完全溶解。用酶標儀測定波長570 nm 處的吸亮度值。

1.3.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測培養基中細胞因子IL-6 和IL-8

實驗分為對照組、LPS 組及低中高三個干預組。對照組由400 μL1%胎牛血清混合培養基構成，脂多糖對照組由200 μL 2×脂多糖+200 μL1%胎牛血清混合培養基構成，干預組則由200 μL 不同濃度2×甘草甜素＋200 μL 2×脂多糖構成。細胞貼壁后，吸去孔板中的細胞培養基，用微量移液器往實驗組培養孔中注入2×甘草甜素，200 μL/孔。再往空白對照組、脂多糖對照組及藥物對照組中添加1%胎牛血清混合培養基，其中空白對照組400 μL/孔，脂多糖對照組200 μL/孔。蓋上培養板的蓋子，標記時間，放入細胞培養箱中培養，并開始計時；22 h 后，取出細胞培養板，用微量移液器將每孔中的上清液轉移至Eppendorf 管，并在管身標記組別以示區分。采用ELISA 檢測培養基中細胞因子IL-6和IL-8的產生。

1.3.3 蛋白免疫印記實驗（Westernblot）檢測各組COX-2 和NF-κB 蛋白水平

①裂解細胞，提取總蛋白：取出細胞培養板，胰酶消化細胞，4℃，離心，500 r/m×3 min，收集細胞，每孔細胞加400 μL 的細胞裂解混合液，于冰上裂解30 min，每5 min 來回搖動培養板一次。細胞裂解完畢后，移至1.5 mL 的EP 管中。于4℃，12 000 rpm 離心5 min。將離心后的上清液分裝轉移到0.5 mL 的EP 管中放于-20℃保存。②提取核蛋白：用冷PBS 洗滌細胞兩遍，轉移至預冷的1.5 mL 的EP 管中。4℃，500 prm 離心3 min。棄上清液，加入5 倍體積的預冷的Buffer A，最大轉速渦旋劇烈振蕩30 s，放置冰上15 min；加入上液體1/20 體積的Buffer B，劇烈禍旋振蕩10 s，冰浴1 min，4℃，16 000 prm，離心5 min，沉淀即是核蛋白粗提物；在沉淀中加入預冷的Buffer 最大轉速渦旋劇烈振蕩15 s，放置冰上40 min，每間隔10 min 渦旋劇烈振蕩15 s；4℃，16 000 prm 離心10 min，將上清液轉移至新的EP 管中，即得細胞核蛋白產物；上述提取的蛋白進行蛋白定量（BCA 法），分裝并保存于-80℃。③蛋白變性：將提取的細胞蛋白與蛋白上樣Buffer按1∶1 比例充分混勻后，在100℃加熱5 min 使蛋白變性。④蛋白表達檢測：采用Westernblot 檢測各組COX-2 和NF-κB 蛋白水平。

1.4 統計學方法

采用SAS 9.4 軟件進行數據處理；計數資料采用（）描述，兩組間采用t檢驗；多組間采用方差分析，對于細胞活性、IL-6 及各組蛋白的表達等均數的多重比較采用SNK（Student-Newman-Keuls）檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度甘草酸對人牙齦成纖維細胞活性的影響

劑量為30、60、120 μg/mL的甘草甜素對HGFs的細胞活力無明顯影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。劑量為240 μg/mL的甘草甜素明顯抑制了HGFs的細胞活力，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度甘草酸對人牙齦成纖維細胞活性的影響Figure 1 Effects of different doses of glycyrrhizic acid on the activity of human gingival fibroblasts

2.2 甘草酸對LPS誘導的IL-6和IL-8產物的抑制作用

與對照組相比，LPS 組IL-6 和IL-8 的濃度顯著増高，差異有統計學意義（P＜0.05）。與LPS 組相比，干預組的IL-6 和IL-8 表達水平隨著甘草甜素的濃度的增加顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 甘草酸對LPS 誘導的IL-8 和IL-6 的抑制作用（±s）Table 1 Inhibitory effect of glycyrrhizic acid on IL-8 and IL-6 induced by LPS（±s）

表1 甘草酸對LPS 誘導的IL-8 和IL-6 的抑制作用（±s）Table 1 Inhibitory effect of glycyrrhizic acid on IL-8 and IL-6 induced by LPS（±s）

注：與對照組相比，aP＜0.05;與LPS 處理組相比,bP＜0.05;與低劑量干預組相比，cP＜0.05；與中劑量干預組相比，dP＜0.05。

組別對照組LPS 處理組低劑量干預組中劑量干預組高劑量干預組F 值P 值IL-6（ng/mL)0.06 ± 0.01 0.73 ± 0.11a 0.54 ± 0.09ab 0.33 ± 0.05abc 0.12 ±0.03bcd 472.32＜0.001 IL-8（ng/mL)0.05 ± 0.01 0.69 ± 0.09a 0.42 ± 0.07ab 0.27 ± 0.05abc 0.13 ± 0.04abcd 543.53＜0.001

2.3 甘草甜素對COX-2/NF-κB 表達的影響

與對照組相比，LPS 組的COX-2 蛋白表達明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05）；與LPS 組相比，干預組的COX-2 蛋白表達水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 甘草甜素對COX-2/NF-κB 表達的影響Figure 2 The Effect of glycyrrhizin on COX-2/NF-κB expression

3 討論

牙周炎是一類由附著于牙面的牙菌斑中的微生物所引起的牙周組織的慢性炎癥，臨床表現為牙周支持組織的炎癥、牙周袋形成、附著喪失和牙槽骨的吸收破壞，最終導致牙齒的松動、脫落，對患者口腔功能和生活質量造成了嚴重的影響［1-4］。牙齦卟啉單胞菌是其主要致病菌，其LPS 可誘導人牙齦成纖維細胞炎癥介質釋放［4］。說明牙齦卟啉單胞菌脂多糖能成功誘導人牙周膜細胞分泌IL-6 和IL-8 介導牙周炎癥反應。這些炎癥介質中白細胞介素6（IL-6）和白細胞介8（IL-8）等炎性細胞因子在疾病發生發展過程中起到了重要的病理作用［10-14］，具有誘導牙周組織損傷的能力。IL-6 參與牙周炎活動期的炎癥和免疫反應，通過誘導破骨細胞的生成、聚集以及破骨活性的發揮，從而加劇牙周組織的破壞。本研究結果與以往發現一致，LPS 能夠顯著增強人成纖維細胞IL-6 及IL-8 的表達。

目前臨床常用的抗菌藥物中以防腐劑和抗生素緩釋劑占主導，如氯己定漱口水和派力奧（鹽酸米諾環素軟膏），這些藥物的長期、大量使用易誘發過敏和毒副作用的產生，國際上對抗生素的應用亦持謹慎態度，因此尋找一種安全有效、無毒副作用的治療方式對與維護患者的機體健康和提高生活質量具有重要的臨床意義［15-16］。甘草甜素是從甘草中分離出來三萜類成分，又稱甘草酸，可水解產生兩分子葡萄糖醛酸和一分子（18β2）甘草次酸，主要作用為抗炎、抗變態反應，免疫調節。本實驗采用甘草甜素治療，發現其抗炎作用呈現劑量依賴性，隨著劑量增強能顯著抑制IL-6、IL-8 的表達［17］。

COX-2 在牙周損傷中發揮重要作用［6-7］。本研究發現LPS 能顯著增加COX-2 的蛋白表達。甘草甜素治療能顯著抑制COX-2 的表達，而且隨甘草甜素濃度的增高，COX-2 表達水平降低。LPS 能誘導NF-κB p65 的磷酸化，甘草甜素的治療顯著抑制LPS 誘導的NF-κB p65 磷酸化，且呈劑量依賴性。核轉錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是細胞核內重要的核轉錄因子，在細胞刺激介導的細胞信息轉錄調控中起關鍵作用。NF-κB 在細胞中主要以p50/p65 二聚體形式存在，其中p65 亞基含有轉錄激活結構域。NF-κB 介導的信號通路參與體內多種反應過程，被認為是經典的炎癥相關信號通路［18-19］。本研究發現LPS 能顯著增加P65 的蛋白表達。而甘草甜素治療能顯著抑制P65 的表達。

目前國內尚無特異性針對牙周致病菌治療和預防牙周病的藥物，本研究以甘草甜素牙周局部給藥的方式改善牙周病變部位的微環境，達到控制牙周炎癥的效果。但由于口腔的微生物環境復雜，牙周病的感染往往是多種細菌的協同混合感染，并涉及局部和全身的諸多易感因素，本實驗模擬了牙周主要致病菌之一牙齦卟啉單胞菌的感染情況，實驗條件相對單尚不能完全模擬人體牙周炎的感染環境，且標準菌株與臨床患者口腔中分離的野生菌株在致病能力上仍有一定差異，因此甘草甜素應用于牙周病患者口腔內的抗菌效果還有待進一步深入研究。