兩種檢測策略在細胞庫病原體污染的檢出分析

曾勁峰 梅秋紅 張耿 鄔林楓 李然 許曉絢 趙鈺 熊文 劉沐蕓★ 王立林★

在細胞庫供者樣本病原體檢測方面，我國還未制定專門的標準。可參照的標準為《臍帶血造血干細胞庫技術規范（試行）》［1］，其對于病原體檢測指定參照《血站管理辦法》［2］。而在國際方面，全球先進輸血和細胞治療聯盟（Advancing Transfusion and Cellular Therapies Worldwide，AABB）與細胞治療認證機構（Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy，FACT）均列出要檢測乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）、人類免疫缺陷病毒（HIV1/2）等病毒，并且指明必須采取病毒核酸檢測（Nucleic Acid Testing）方法。因此，依據目前國際行業規范，結合我國政策法規，有兩種檢測策略可供選擇：一種為參照《血站技術操作規程（2015 版）》［3］規定采用1～2 種血清學酶聯免疫吸附分析（Enzyme Linked Immune Sorbent Assay，ELISA）法檢測病原體抗原抗體，同時采用1 種核酸檢測試劑檢測病毒核酸，簡稱血篩檢測策略（Blood screen strategy，BSS）；另一種為參照衛健委發布的病毒臨床診斷檢測標準［4-8］，采用1種臨床診斷血清學試劑檢測病原體抗原或抗體，簡稱臨床檢測策略（Clinical detection strategy，CDS）。本研究采用BSS 與CDS 檢測病原體，病原體類型包括HBV、HCV、HIV 與梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP），并對檢測結果的差異進行綜合分析，判斷兩種策略在檢測細胞庫病原體污染效果的差異，同時分析血篩檢測策略中血清學檢測方法與核酸檢測方法之間的差異性，以確定核酸檢測在細胞庫病原體污染風險防控中的作用及效果。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選取深圳綜合細胞庫2016年2月至2017年7月7 981 例細胞供體的外周血標本，其中來源于孕產婦的標本7 571 例，均為孕產婦生產前或生產后7 天內進行采樣，來源于非孕產婦的成人標本410例，為細胞樣本采集前或細胞樣本采集后7 天內采集供者外周血標本。

1.2 檢測設備及試劑

設備：FAME24/30 酶免疫檢測儀器（瑞士HAMILTON），TECAN RSP/200 酶免疫加樣器（瑞士TECAN），美國Grifols 公司全自動核酸檢測平臺Procleix Tigris 核酸檢測系統；試劑：進口檢測試劑有意大利Diasorin HBsAg ELISA 檢測試劑、美國強生ORTHO 抗-HCV ELISA 檢測試劑、美國伯樂Genscreen ULTRA 抗-HIV/Ag ELISA 檢測試劑、意大利Diasorin 梅毒螺旋體特異性抗體檢測試劑，美國Grifols Procleix Ultrio Assay 試劑，國產試劑有北京萬泰HBsAg ELISA 檢測試劑、珠海麗珠抗-HCV ELISA 檢測試劑、北京萬泰抗-HIV ELISA 檢測試劑、珠海麗珠梅毒螺旋體特異性抗體檢測試劑、北京萬泰HTLV ELISA 檢測試劑。

1.3 臨床檢測策略

由細胞標本采集醫院按照術前或產前傳染病檢測要求及標準對供者在細胞采集前抽血進行HBV、HCV、HIV1/2 及TP 的抗原/抗體檢測，深圳綜合細胞庫收集匯總檢測報告結果。

1.4 血篩檢測策略

由深圳市血液中心參照血篩檢測標準，采用上述進口及國產試劑對深圳市綜合細胞庫細胞供者抗凝血樣本進行HBsAg、抗HCV、抗HIV、梅毒螺旋體抗體及HBV/HCV/HIV 病毒核酸定性檢測，所有檢測結果均為非反應性則報為非反應性結果，否則計為反應性結果。

1.5 確診實驗

抗-HIV 陽性樣本送深圳市疾病預防控制中心做HIV 蛋白印跡法確證試驗檢測，梅毒螺旋體特異性抗體陽性樣本送深圳市慢性病防治中心采用日本富士（FUJIREBIO）TPPA 法進行檢測。

1.6 統計方法

采用IBM SPSS Statistics 21.0 軟件進行統計學分析；采用Kappa 檢驗上述兩種檢測策略及方法的一致性；兩種檢測策略及方法比較采用配對卡方檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDS 與BSS 檢測結果對比

兩者檢測結果比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 CDS 與BSS 檢測結果對比Table 1 Comparison of detection results between CDS and BSS

2.2 各檢測項目兩種檢測策略結果對比

兩種檢測策略在HBV、TP、HCV 檢測結果比較，差異有統計學意義（P＜0.005）。見表2。

表2 各檢測項目兩種檢測策略結果對比Table 2 Comparison of results of two test strategies for each test item

2.3 血篩策略中血清學ELISA 檢測與NAT 檢測結果分析比較

血篩檢測策略中HBV、HCV、HIV 血清學ELISA 檢測與病原體核酸檢測（nucleic acid detection，NAT）兩種方法檢測結果一致性一般（K=0.651）；兩種檢測方法檢測結果比較，差異有統計學意義（P＜0.001）。見表3。兩種檢測方法對HBV 檢測結果一致性非常好（K=0.833）；兩種檢測方法檢測結果比較，差異有統計學意義（P＜0.001）；兩種方法對HCV 與HIV 檢測結果一致性較差（K=0）。見表4。

表3 BSS 中ELISA 檢測與NAT 檢測結果總體分析Table 3 Overall analysis of ELISA and NAT detection results in DSS

表4 BSS 中ELISA 檢測與NAT 檢測對HBV、HCV、HIV結果分析Table 4 ANALYSIS of HBV，HCV and HIV results by ELISA and NAT in BSS

2.4 血篩檢測陽性樣本中各項目占比分析

各項目陽性檢出率及占比為：HBsAg 與HBVDNA 是占比最高的項目，分別為30.45%與27.27%。見表5。

表5 血篩檢測各項目陽性占比分析統計Table 5 Analysis and statistics of the positive proportion of each item in BSS

2.5 確證試驗

對23例抗-HCV陽性樣本進行RIBA確證實驗發現樣本均為陰性和不確定，無一例陽性；對51 例SYP陽性樣本進行TPPA 檢測，結果顯示20 例陽性，31 例陰性，真陽性率為39.22%；對12例抗HIV陽性樣本進行蛋白印跡法確證實驗，證實其樣本均為陰性。

3 討論

CDS 與BSS 兩種檢測策略在細胞庫樣本供體血液標本檢測結果上存在差異，其產生的原因可能是因為BSS 采用ELISA 和NAT 兩種方法，共同來確定結果，從而導致與CDS 結果出現顯著差異。采用BSS 對細胞供者進行篩查檢驗，ELISA 雙試劑較單試劑檢測具有更高的檢測靈敏度，同時采用NAT方法對HBV、HCV 和HIV 進行篩查，能提高病原體感染窗口期的檢出率，尤其是在HBV 方面顯示出較好效果（提高HBV 窗口感染期檢出率11.67%），能更好的防范病原攜帶樣本混入正常的細胞庫。

從血清學檢測的確認結果（HBV 除外）可以發現，本研究中樣本的假陽性率高于普通獻血人群，分析原因可能為研究樣本多來源為孕產婦血清樣本，其孕產期受激素和孕期的影響，較一般人群更易產生非特異性抗體，易產生假陽性結果。根據Wesolowski 等的研究報道孕婦初篩試驗的假陽性率約為0.14%［9］。國內研究者也分析了孕婦的傳染病檢測項目的假陽性情況，蔣春云等研究者對7例ELISA HIV 反應性孕婦追蹤確認檢測中發現，有3 例孕婦在追蹤后抗體陽轉，而其余4 名孕婦HIV 抗體和核酸檢測持續陰性［10］。目前血篩HIV檢測主要采用第四代檢測試劑［11］，另有研究者分析了孕婦HIV 電化學發光的假陽性情況，16 例篩查反應性樣本中，HIV 確認檢測1 例陽性，其余15例為陰性［12］。對孕婦的梅毒ELISA 研究也發現，ELISA 檢測的假陽性較高，可達8.49%［13］。

由此可見，采用DSS 對細胞庫供體血液檢測，靈敏度較高，可以有效防止細胞庫的病原體污染。但針對孕婦這一特殊群體，在初篩之外，應結合確認實驗或NAT 結果，可減低假陽性率。

雖然BSS 中應用的雙試劑檢測可提高檢測靈敏度，但ELISA 存在因“窗口期”、病毒變異、免疫沉默等造成的漏檢，在目前使用的ELISA 檢測試劑的條件下，HBsAg、抗-HCV 及抗-HIV 的平均“窗口期”分別約為59 d、72 d 及22 d［14］。而采用NAT，可將HBV、HCV 及HIV 的平均“窗口期”分別縮短至20 d、10 d 及7 d［15-16］，專家甚至建議有必要采用高靈敏度的核酸檢測技術應用于術前篩查［17］，可見應用NAT 可提高整體檢測系統的靈敏度，降低檢測后感染的殘余風險。

由此可見，BSS 檢測靈敏度更高，在細胞庫病原體污染風險防控中應采用此策略，整體上降低任何單一檢測方法不準確導致的病原體漏檢風險，避免病原體交叉污染，保證細胞庫儲存樣本安全。