GOLPH3在肺癌組織中的表達及其對肺癌細胞侵襲和遷移的影響

王智園 楊曼 劉士岳 蘇國苗 雷梓★

肺癌的發生及侵襲轉移機制復雜，受到多種基因的調控［1-3］。高爾基磷酸化蛋白-3（Golgi phosphoprotein-3，GOLPH3），也被稱為MIDAS、GPP34、GMx33，是新近發現的定位于高爾基網的具有強大轉化能力的癌基因［4-6］。研究表明GOLPH3 在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多種實體腫瘤組織中表達明顯上調［7-10］。GOLPH3 在肺癌的發生及侵襲轉移中的作用機制尚不明確，但有體外實驗研究表明，封閉GOLPH3 基因后，腫瘤細胞被明顯抑制，提示GOLPH3參與惡性腫瘤的發生及發展。為探究GOLPH3 是否與肺癌的發生及侵襲轉移相關，本研究分析GOLPH3 蛋白表達與肺癌臨床病理學特征之間的關系；構建沉默GOLPH3 的肺癌A549 細胞，以分析GOLPH3 對肺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，為非小細胞肺癌靶向治療提供潛在的新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年至2020年間于昆明醫科大學第一附屬醫院進行手術切除的非小細胞肺癌組織72例，其中61 例具有對應的遠離癌的肺組織（遠癌組織），遠癌組織來源于距癌組織邊緣5 cm 以上的肺組織。病例納入標準：①所有病例均未行術前放化療；②術前檢查排除遠處轉移；③術后病理檢查確診非小細胞肺癌。排除標準：排除術后1 個月內死亡者。研究經昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準并取得患者知情同意。

1.2 材料與試劑

肺腺癌細胞A549 細胞購買于中國科學院昆明動物研究所，RPMI-1640 培養液、胎牛血清（#C04001-500）購于以色列BI（Bioind）公司，針對GOLPH3 基因特異性構建并包裝的可供直接轉染的慢病毒載體和陰性對照慢病毒載體購自上海吉瑪制藥技術有限公司。RIPA（#P0013K）細胞裂解液、BCA（#P0010）試劑盒和增強化學發光ECL（P0018FS）試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell 小室購自美國Millipore 公司，Matrigel（#356234）購自美國Becton，Dickinson and Company；兔抗人GOLPH3（#abs111104）50 μL 多克隆抗體購自愛必信（absin）公司，兔抗人E-Cadherin（24E10，#3195）100 μL 和兔抗人Vimentin（D21H3，#5741）100 μL 單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法檢測組織內GOLPH3 表達

組織標本常規制片，H-E 染色，光鏡下觀察腫瘤形態學特征。免疫組化使用SP 法染色，一抗用GOLPH3 多克隆抗體。免疫組化結果按照IRS 評分法判斷［11］：以陽性細胞數評分和陽性細胞強度評分乘積為總評分，以總評分來判斷陽性等級。其中陽性細胞數≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%依次記為0、1、2、3、4 分；陽性細胞強度中不著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別記為0、1、2、3分。總評分0～3 分、4～6 分、7～9 分、10～12 分依次記為陰性、弱陽性、陽性、強陽性。

1.3.2 細胞培養、轉染與分組

將肺腺癌A549 細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中，用0.25%的含EDTA 的胰酶傳代。置于37℃，含5% CO2，且飽和濕度條件下進行培養，待融合度達到80%時，0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。穩定轉染的GOLPH3基因沉默技術構建細胞：在GenBank 中查找人GOLPH3基因mRNA 序列，根據shRAN 設計原則，利用BLAST 進行同源性分析，設計出GOLPH3-shRNA 序列。構建GOLPH3-shRNA 質粒，建立穩定轉染下調GOLPH3基因A549 細胞，為GOLPH3 沉默組，轉染空質粒為對照組。繼續培養24 h 后通過篩選獲得穩定轉染干擾載體的細胞。

1.3.3 劃痕實驗檢測肺癌A549 細胞遷移能力

將細胞接種于6 孔板，待細胞融合后，用200 μL 移液器槍頭在6 孔板底部劃直線，PBS 洗去細胞碎片。于0 和24 h 分別采用Olympus IX50 顯微鏡拍照記錄細胞遷移的圖像，以遷移率表示細胞的遷移能力。

1.3.4 Transwell 侵襲試驗檢測肺癌A549 細胞侵襲能力

采用8 μm 孔徑的Transwell 小室進行細胞侵襲試驗，將Matrigel 按1∶8 比例用培養基稀釋后加入小室上室，在上室分別接種10 000 個GOLPH3沉默和對照組的A549 細胞，并在小室下室加入500 μL 含10%胎牛血清的培養基，置于37℃、5%CO2環境中培養24 h 后，用棉簽擦拭上室內未穿膜細胞及基質膠，多聚甲醛固定，蘇木素染色，顯微鏡下觀察穿膜細胞并計數。

1.4 統計學方法

采用Graphpad prism 8.4.2 軟件對數據進行統計分析和作圖；計量資料以（）表示，兩組間比較行獨立樣本t檢驗；計數資料采用n（%）表示，兩組間計數數據用卡方檢驗；P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GOLPH3 表達與肺癌患者臨床病理因素的關系

GOLPH3 主要表達于細胞質，呈棕黃色顆粒，其中GOLPH3 在NSCLC 組中有42 例陽性，顯著高于遠癌組織陽性病例數（23 例）；GOLPH3 在TMN Ⅲ+Ⅳ期組和淋巴結轉移組的陽性率也顯著高于TMNⅠ+Ⅱ期組和淋巴結未轉移組陽性率，差異有統計學意義（P＜0.05）。GOLPH3 的表達陽性率在年齡和性別的分組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1和圖1。

圖1 肺癌組織及GOLPH3 免疫組化結果（HE，×100）Figure 1 Immunohistochemical results of GOLPH3 in lung cancer tissue（HE，×100）

表1 GOLPH3 表達與肺癌患者臨床病理因素的關系［n（%）］Table 1 The relationship between GOLPH3 expression and clinicopathological factors in patients with lung cancer［n（%）］

2.2 GOLPH3 沉默對肺癌細胞遷移能力的影響

劃痕實驗顯示，劃痕24 h后，GOLPH3-shRNA 組中細胞遷移率明顯低于NC-shRNA 組（24.80±3.50）vs（39.17±4.74），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 GOLPH3 沉默對肺癌A549 細胞遷移能力的影響Figure 2 Effect of GOLPH3 silencing on the migration ability of lung cancer A549 cells

2.3 GOLPH3 沉默對肺癌細胞侵襲能力的影響

GOLPH3-shRNA 組中穿過基底膜的細胞數顯著低于NC-shRNA 組（47.40±12.20）vs（123.00±15.70），差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 GOLPH3 沉默對肺癌A549 細胞侵襲能力的影響（蘇木素，×100）Figure 3 Effect of GOLPH3 silencing on invasion ability of lung cancer A549 cells（Hematoxylin，×100）

3 討論

肺癌是目前全世界發病率最高的惡性腫瘤之一，積極探究肺癌發生及侵襲轉移機制，在研究肺癌靶向治療、控制癌變發展、延長肺癌患者生命具有重要意義［12］。癌癥的發生和進展是多基因多步驟的過程，Scott KL［13］等在進行腫瘤基因組分析時發現，乳腺癌、腎癌、直腸癌等多種實體腫瘤內均存在GOLPH3 過量表達情況，確定GOLPH3 是一種原癌基因。GOLPH3 位于染色體5p13，主要存在于高爾基囊泡反面膜外圍，負責高爾基分選活動。GOLPH3 在特定的病理或生理條件下被激活后，將誘導各種惡性腫瘤的發生與進展［14］。徐偉莉等［15］研究發現，結腸癌組織內GOLPH3 表達水平異常升高，且其表達水平與腫瘤遠處轉移、淋巴轉移及臨床分期等多個臨床參數密切相關。為了了解GOLPH3 與非小細胞肺癌的發生發展是否存在關系，本研究結果提示，NSCLC 組織內GOLPH3陽性表達率高于遠癌組織；且在有淋巴結轉移和臨床分期較晚的肺癌病例組織中GOLPH3 的陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移和臨床分期較早的病例，與文獻研究結果一致。提示GOLPH3 高表達與肺癌的發生、進展和轉移間存在密切關系。

在上述研究結果的基礎上，筆者建立了GOLPH3 沉默的A549 細胞，在體外水平觀察GOLPH3基因對肺癌細胞的影響。國內王春曉［16］等通過體外實驗表明，沉默GOLPH3基因可逆轉HT29 結腸癌細胞對順鉑化療的耐藥性。張利科等［17］通過重組慢性病毒方法，分別構建沉默及過表達的GOLPH3 胰腺癌細胞株，并利用過MTT 實驗，傷痕愈合實驗以及Transwell 實驗發現，沉默GOLPH3 可有效抑制人胰腺癌細胞的增殖、侵襲及轉移。國外Cecilia Arriagada 等人［18］敲低人多形性膠質母細胞瘤T98G 細胞GOLPH3 表達后發現粘著斑激酶（FAK）的自激活減少，從而促進細胞的遷移。與以上研究相似，本研究結果發現，GOLPH3沉默組A549 細胞遷移能力明顯減弱，侵襲能力也明顯低于對照組，推測GOLPH3 可提高A549 細胞肺癌細胞侵襲和遷移能力，結果與文獻報道一致。

綜上所述，GOLPH3 在肺癌組織表達高于遠癌組織，且在臨床分期較晚和淋巴結轉移病例表達顯著高于臨床分期較早和淋巴結未轉移的病例，在體外實驗中發現GOLPH3 沉默可減弱肺癌細胞侵襲遷移能力，提示GOLPH3 可促進肺癌的進展和侵襲遷移。因此，抑制GOLPH3 過表達有望成為肺癌靶向治療的可靠方向，但還需更進一步細致研究不同病理類型肺癌中GOLPH3 表達情況及GOLPH3 發揮作用的分子機制，為靶向治療提供更多依據。