血漿循環腫瘤DNA基因突變檢測國家參考品的應用評價

孫楠 于婷 孫晶 賈崢 曲守方 黃杰

肺癌是全世界最常見的癌癥，每年約有170萬人死于該疾病［1］。液體活檢作為一種微創工具，可滿足對包括肺癌在內的惡性腫瘤進行實時監測和個性化治療的迫切需求。細胞循環腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）檢測是一種較為成熟的液體活檢方式，能夠進行縱向監測，全面了解腫瘤的異質性。研究表明使用基于高通量測序又稱二代基因測序（next generation sequencing，NGS）的ctDNA 分析的靈敏度為75%～90%，檢測結果與組織檢測高度一致［2-5］。2016年中國肺癌峰會專家小組會議就液體活檢達成共識并指出：檢測已知的、多個平行臨床可藥物抑制的靶點，用于發現未知基因，探索療效監測、預后判斷和發現耐藥機制等，液體活檢技術推薦NGS 方法［6］。

本研究使用可逆末端終止測序技術對血漿循環腫瘤DNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測國家參考品進行檢測，用于評價基于二代測序技術平臺的以血漿為檢測樣本的腫瘤基因突變檢測試劑盒的性能。

1 材料與方法

1.1 研究對象

血漿ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/ BRAF/MET基因突變檢測國家參考品，批號：360037-201901，87支/套，4.2 mL/支，血漿樣本，由中國食品藥品檢定研究院（中檢院）提供。

1.2 儀器與試劑

Qubit DNA 定量分析儀購自美國Life technologies 公司，實時熒光定量PCR 儀購自美國Life technologies 公司，NextSeq CN500 基因測序分析儀購自杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司，微滴式數字PCR 系統購自美國Bio-Rad 公司，文庫定量試劑（批號：2109868）購自美國KAPA Biosystems公司，DNA 純化試劑盒（磁珠法）（批號：R0037）購自杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司，人類EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因突變聯合檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）（批號：R3002191001）購自杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司，NextSeq CN500 中通量測序試劑盒（批號：R0300）購自杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與建庫

首先提取ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測國家參考品的血漿游離DNA，然后采用人類EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因突變聯合檢測試劑盒（可逆末端終止測序法）對提取的血漿游離DNA進行文庫構建。在樣本DNA 片段兩端添加接頭，然后在連接酶的作用下將帶有接頭的DNA 片段環化。通過在突變位點附近設計背靠背式引物進行反向PCR 擴增，富集目標DNA 片段，獲得線性化的PCR 擴增產物。構建的文庫采用DNA 純化試劑盒（磁珠法）試劑盒進行純化。

1.3.2 終文庫質控

終文庫經過實時熒光定量PCR 檢測，樣品濃度不低于1 nM，方可進行下一步的上機測序。

1.3.3 測序

將文庫進行混合，變性，復性后，加載于芯片上，準備測序用反應試劑，清潔和檢查測序芯片，點擊NextSeq Control Software（NCS）圖標，NCS 初始化完成后，從NCS 的主界面點擊Sequence，測序芯片艙門打開，放入芯片，當所有運行前測試都通過，點擊Start，開始測序。

1.3.4 結果判讀

通過生物信息軟件分析，識別攜帶基因突變的腫瘤DNA 序列，獲得相關基因突變信息。

2 結果

2.1 終文庫質控結果

樣品文庫濃度均≥1 nM。見表1。

表1 終文庫質控結果Table 1 Final library quality control results

2.2 特異性結果

對國家參考品中的陰性參考品進行檢測，試劑盒聲稱可檢測的27 種突變檢測結果的突變reads 均為0 條，為突變陰性；基因融合檢測，融合突變reads 數均為0 條，為融合突變陰性。見表2。對試劑盒范圍外的國家陽性參考品進行檢測，試劑盒聲稱可檢測的27 種突變檢測結果均為突變陰性；3 種基因融合檢測，為融合突變陰性。

表2 陰性參考品檢測結果Table 2 Negative reference result

2.3 單核苷酸變異（single nucleotide variant）和插入缺失突變（insertion-deletion）結果

對試劑盒檢測范圍內的國家陽性參考品進行檢測，符合文庫下機數據質量要求。對參考品的突變位點檢測，突變reads 數均大于1，均為相應位點的突變陽性。見表3。

表3 陽性參考品檢測結果Table 3 Positive reference result

2.4 檢測限結果

對試劑盒檢測范圍內的1%和0.3%突變頻率檢測限參考品進行檢測，標注的KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變位點和其他突變位點均檢出陽性。對試劑盒檢測范圍內的EGFR/MET基因拷貝數擴增陽性參考品進行檢測，結果檢出陽性。對試劑盒檢測范圍內的0.1%突變比例檢測限參考品進行檢測，根據試劑盒聲稱的檢測限，標注的KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變位點和其他突變位點檢出（不高于0.1%突變頻率）或未檢出。見表4。

表4 檢測限參考品結果Table 4 Detection limit reference result

3 討論

液體活檢可用于晚期癌患者或由于其它原因不能獲取腫瘤組織樣本的患者［7-8］，主要應用于個性化用藥指導，腫瘤發展過程監測等［9］。液體活檢最大的挑戰是腫瘤患者體內ctDNA 濃度可低至整個循環DNA 的0.01%［10-11］，因此對于檢測技術檢測下限的研究很重要。有研究表明可使用細胞系或基因編輯的細胞系作為標準化的樣本，對檢測限附近的檢出能力進行研究驗證［12］。另外基于NGS 的方法檢測ctDNA 時，需要使用超深測序（＞10 000×原始覆蓋），以達到適合的檢測限（≤0.1%）［13-14］。

目前沒有關于高通量測序法檢測ctDNA 的行業標準，也沒有相關的國家參考品或國際參考品。據國家衛生健康委臨床檢驗中心公布《2019年腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測室間質量評價》結果，我國各實驗室ctDNA 基因突變檢測總體合格率僅為80%，其中173 個假陽性突變結果、67 個假陰性結果。

為評價基于不同NGS 平臺的液體活檢試劑盒的質量和性能，開展ctDNA 檢測標準化研究，中檢院建立了血漿ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測國家參考品（批號：360037-201901）用于相關試劑盒的性能評價，包括準確性、特異性及檢測限［15］。該參考品對試劑盒檢測范圍內標注的基因突變位點均應檢出；對試劑盒檢測范圍外標注的基因突變位點均不應檢出；對試劑盒檢測范圍內的1%和0.3%突變比例檢測限參考品進行檢測，標注的基因突變位點均應檢出。

參考品原料系提取自野生型或各種基因突變細胞系基因組DNA，經酶切打斷后，加入血漿樣本中。為保證國家參考品的換批連續性，本參考品通過建立永生化細胞系，獲得細胞基因組DNA 作為原料。本研究的局限性在于國家參考品不包括融合突變的基因類型，因此未對試劑盒的ALK、ROS1、RET三個基因的融合突變的檢測能力進行評價。

本研究是基于高通量測序平臺，首先利用環化單分子擴增，獲得線性化的PCR 擴增產物。然后通過對擴增產物進行高通量測序，準確識別攜帶基因突變的腫瘤DNA 序列，獲得相關基因突變信息。該技術能夠滿足血漿ctDNA KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測國家參考品的要求，為ctDNA 腫瘤基因檢測提供了一種可靠的檢測方法。

綜上所述，血漿ctDNA KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測國家參考品可以有效保障ctDNA 檢測的準確性，可以提升相關診斷試劑的質量控制水平，有利于加快循環腫瘤DNA 檢測標準化的進程。