丹參酮ⅡA對CVB3感染的小鼠原代心肌細胞氧化損傷及凋亡的影響及其機制研究

肖文濤 張靜 郭素萍 胡振杰 李江 高傳玉

病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是一種繼發于病毒感染的心肌炎性疾病，在年輕人中多發，可引發心力衰竭、猝死等致命性傷害［1］。據報道，腸道病毒，特別是柯薩奇病毒B3（CVB3）是導致病毒性心肌炎的最常見病毒［2］。鑒于最常見的心肌炎誘因是病毒感染，開發有效的抗病毒藥物對治療病毒性心肌炎具有重要意義。丹參酮ⅡA（TanshinoneⅡA，TanⅡA）是丹參酮的主要活性成分，具有抗氧化、抗病毒、調節免疫等多種藥理學功能［3］。丹參酮ⅡA 已廣泛用于心血管疾病的治療［4-7］。然而丹參酮ⅡA 在病毒性心肌炎中的影響及作用機制的研究相對匱乏，因此本實驗以CVB3感染小鼠原代心肌細胞在體外模擬病毒性心肌炎，探究丹參酮ⅡA 對病毒性心肌炎細胞損傷和凋亡的影響及可能的機制，以期為病毒性心肌炎臨床治療提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

6 周齡SPF 級BALB/C 雄性小鼠（中國科學院實驗動物中心）；丹參酮ⅡA（南京景竹醫藥科技有限公司）；DMEM 培養基（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；胎牛血清（美國Life Technologies 公司）；CVB3 病毒（美國菌種保藏中心）；CCK-8 試劑（日本同仁化學研究所）；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（美國Sigma 公司）；SOD 活力檢測試劑盒、MDA含量檢測試劑盒、GSH-Px 活力測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA 檢測試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；AnnexinⅤ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（日本TaKaRa 公司）；ECL 化學發光試劑（上海碧云天生物技術研究所）；PVDF 膜（美國密理博公司）；Cleaved Caspase-3 單抗、TLR4 單抗、NF-κB 單抗、p-NF-κB 單抗及二抗（美國Santa Cruz 公司）。

1.2 心肌細胞分離及處理分組

參照文獻［8］分離小鼠心肌細胞，即取小鼠心臟組織，剪碎，以胰酶消化，差速貼壁法獲取小鼠原代心肌細胞。實驗已通過本院實驗動物倫理委員會審查。分離的心肌細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM 培養基中，放置在37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱進行培養。在6 孔板中接種1.0×105個/孔細胞，待單層貼壁生長，向細胞中加入10 倍MOI的CVB3（根據預實驗結果），輕輕混勻，37℃孵育1 h，記為模型（CVB3）組，丹參酮ⅡA 治療（CVB3+TanⅡA）組以CVB3 感染后使用濃度為10 μmol/L的丹參酮ⅡA 處理，正常對照組接種同劑量的PBS，丹參酮ⅡA（TanⅡA）組使用濃度為10 μmol/L的丹參酮ⅡA 處理，利巴韋林治療（CVB3+Rib）組以CVB3 感染后使用濃度為200 μg/mL 的丹參酮ⅡA 處理。

1.3 CCK-8 法檢測心肌細胞活性

心肌細胞以3×103個/孔加入到96 孔板中，按照1.2 方法處理和分組，每組設置3 個復孔，分別在24 和48 h 向各孔細胞內加入CCK-8 溶液10 μL，孵育2 h，酶標儀測定450 nm 處的光密度值（OD 值），參比波長為600 nm，分別計算各組心肌細胞活性，細胞活性（%）=實驗組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.4 試劑盒測定SOD 和GSH-Px 活性和MDA含量

各組心肌細胞處理48 h后，收集細胞及上清培養液，分別參照SOD、MDA 和GSH-Px 檢測試劑盒說明書對SOD 和GSH-Px活性及MDA 含量進行檢測。

1.5 ELISA檢測炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平

各組心肌細胞處理48 h 后，收集上清培養液，使用ELISA 檢測試劑盒對IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平進行檢測，具體操作步驟參考制造商說明書。

1.6 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率

心肌細胞分組處理48 h 后，收集3×105個細胞，采用AnnexinⅤ-FITC/PI 試劑盒說明書處理，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western blot 檢測心肌細胞中Cleaved Caspase-3、TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平

抽提處理48 h 各組心肌細胞總蛋白，BCA 法測定上清中蛋白濃度。蛋白加熱變性。等量蛋白行10% SDS-PAGE 凝膠電泳，隨后電轉至PVDF膜，于5%脫脂奶粉中封閉2 h，參照一抗說明書按1∶1 000 稀釋Cleaved Caspase-3、TLR4、NF-κB 和p-NF-κB，加入相應一抗，4℃過夜孵育，再加入1∶3 000 稀釋的二抗，室溫封閉2 h，以ECL 進行顯影，使用成像系統采集圖像，以GAPDH 為內參，分別計算目的蛋白相對表達水平。

1.8 統計學分析

采用SPSS 21.0 統計學軟件對數據進行分析，計量資料以（）表示，均符合正態分布，兩組間用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA 對CVB3 誘導的心肌細胞活性的影響

與對照組相比，CVB3 組心肌細胞活性顯著降低（P＜0.05）；與CVB3 組相比，CVB3+TanⅡA 組心肌細胞活性明顯增強（P＜0.05）。見表1。

表1 各組心肌細胞活性比較（±s）Table 1 Comparison of cardiomyocyte activity in each group（±s）

表1 各組心肌細胞活性比較（±s）Table 1 Comparison of cardiomyocyte activity in each group（±s）

注：與Control 組比，*P＜0.05；與CVB3 組比，&P＜0.05。

組別對照組TanⅡA CVB3 CVB3+TanⅡA CVB3+Rib F 值P 值細胞活性（%）0 h 100.00±5.12 99.02±5.04 98.46±4.89 98.22±5.02 99.11±5.17 0.056 0.993 24 h 99.64±5.11 96.48±5.26 76.28±4.61a 88.32±4.06b 90.14±4.37b 11.047 0.001 48 h 97.85±5.14 96.33±5.39 52.16±3.65a 80.92±4.33b 84.57±4.27b 48.006 0.000

2.2 丹參酮ⅡA 對CVB3 誘導的心肌細胞氧化應激的影響

與對照組相比，CVB3 組SOD 和GSH-Px 活性明顯降低（P＜0.05），MDA 含量明顯增多（P＜0.05）；與CVB3 組相比，CVB3+TanⅡA 組SOD 和GSHPx 活性上升（P＜0.05），MDA 含量下降（P＜0.05）。見表2。

表2 各組心肌細胞SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量比較（±s）Table 2 Comparison of SOD and GSH-Px activities andMDA content of cardiomyocytes in each group（±s）

表2 各組心肌細胞SOD 和GSH-Px 活性及MDA 含量比較（±s）Table 2 Comparison of SOD and GSH-Px activities andMDA content of cardiomyocytes in each group（±s）

注：與對照組組比，aP＜0.05；與CVB3 組比，bP＜0.05。

組別對照組TanⅡA CVB3 CVB3+TanⅡA CVB3+Rib F 值P 值SOD（U/mL）77.63±6.11 75.28±6.08 58.04±5.02a 71.26±6.07b 73.44±6.81b 4.847 0.0020 MDA（U/mL）12.52±0.13 13.41±1.01 28.65±3.02a 16.14±1.70b 14.15±1.57b 42.919 0.000 GSH-Px（U/mL）148.92±10.21 145.12±11.75 91.38±8.11a 133.74±9.61b 139.26±12.08b 14.851 0.000

2.3 丹參酮ⅡA 對CVB3 誘導的心肌細胞炎癥反應的影響

與對照組相比，CVB3 組IL-1β、IL-6 和TNF-α水平升高（P＜0.05）；與CVB3 組相比，CVB3+TanⅡA 組IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平明顯下降（P＜0.05）。見表3。

表3 各組心肌細胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較（±s）Table 3 Comparison of levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in cardiomyocytes of each group（±s）

表3 各組心肌細胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較（±s）Table 3 Comparison of levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in cardiomyocytes of each group（±s）

注：與對照組組比，aP＜0.05；與CVB3 組比，bP＜0.05。

TNF-α（pg/mL）21.41±2.32 35.45±3.14 367.95±36.84a 107.85±10.44b 76.52±7.63b 195.750 0.000組別對照組TanⅡA CVB3 CVB3+TanⅡA CVB3+Rib F 值P 值IL-1β（pg/mL）12.52±0.13 11.81±1.04 28.65±3.02a 16.14±1.70b 14.24±1.38b 47.595 0.000 IL-6（pg/L）0.71±0.07 0.68±0.06 3.55±0.37a 1.06±0.13b 0.91±0.09b 131.406 0.000

2.4 丹參酮ⅡA對CVB3誘導的心肌細胞凋亡的影響

與對照組相比，CVB3 組心肌細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 的表達升高（P＜0.05）；與CVB3組相比，CVB3+TanⅡA 組細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達明顯降低（P＜0.05）。見圖1和表4。

表4 各組心肌細胞凋亡率比較（±s）Table 4 Comparison of apoptosis rate of cardiomyocytes in each group（±s）

表4 各組心肌細胞凋亡率比較（±s）Table 4 Comparison of apoptosis rate of cardiomyocytes in each group（±s）

注：與對照組組比，aP＜0.05。

組別對照組TanⅡA CVB3凋亡率（%）2.52±0.59 2.88±0.62 25.79±3.24a Cleaved Caspase-3 0.11±0.01 0.12±0.01 0.52±0.05a

圖1 丹參酮ⅡA 對CVB3 誘導的心肌細胞凋亡和Cleaved Caspase-3 表達的影響Figure 1 The effect of Tanshinone ⅡA on CVB3-induced cardiomyocyte apoptosis and Cleaved Caspase-3 expression

2.5 丹參酮ⅡA 對CVB3 誘導的心肌細胞中TLR4/NF-κB 信號通路激活的影響

與對照組相比，CVB3 組心肌細胞中TLR4 和p-NF-κB 的表達上調（P＜0.05）；與CVB3 組相比，CVB3+TanⅡA 組細胞中TLR4 和p-NF-κB 的表達明顯下調（P＜0.05）。見圖2和表5。

圖2 Western blot 檢測各組心肌細胞中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達Figure 2 Western blot detection of TLR4，NF-κB and p-NF-κB protein expression in cardiomyocytes of each group

表5 各組心肌細胞中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平比較（±s）Table 5 Comparison of TLR4，NF-κB and p-NF-κB protein expression levels in cardiomyocytes of each group（±s）

表5 各組心肌細胞中TLR4、NF-κB 和p-NF-κB 蛋白表達水平比較（±s）Table 5 Comparison of TLR4，NF-κB and p-NF-κB protein expression levels in cardiomyocytes of each group（±s）

注：與對照組比，aP＜0.05；與CVB3 組比，bP＜0.05。

p-NF-κB 0.32±0.03 0.33±0.03 0.63±0.06a 0.41±0.04b 0.38±0.03b 30.247 0.000組別對照組TanⅡA CVB3 CVB3+TanⅡA CVB3+Rib F 值P 值TLR4 0.11±0.01 0.12±0.01 0.89±0.09a 0.23±0.02b 0.21±0.02b 176.736 0.000 NF-κB 0.82±0.08 0.81±0.08 0.83±0.07 0.81±0.08 0.80±0.07 0.067 0.991

3 討論

心肌炎定義為心肌損傷后心肌的炎癥，也是引發小兒心力衰竭患者的主要原因之一［9］。腸道病毒感染被認為是該疾病的一個主要原因，尤其是年輕患者中CVB3 的感染。CVB3 是一種重要的人類病原體，可誘導兒童和年輕人的急性和慢性病毒性心肌炎［10］。大約50%的心肌炎及其末期擴張型心肌病可歸因于CVB3 感染［11］。目前關于病毒性心肌炎的發病機制尚不完全清楚，且缺乏病毒性心肌炎治療的特效藥。因此探究病毒性心肌炎的發病機制及開發有效的藥物對病毒性心肌炎的臨床治療顯得尤為重要。

丹參酮ⅡA 來源于唇形科植物丹參的根及根莖，主要用于治療冠心病、心律過速、心絞痛等心血管疾病［12］。近期研究顯示，丹參酮ⅡA 磺酸鈉注射液廣泛治療病毒性心肌炎的小鼠模型及臨床應用［13］。本實驗結果提示丹參酮ⅡA 對CVB3 誘導的心肌細胞具有一定的保護作用。以往研究發現丹參酮ⅡA 可能通過調控氧化應激反應和炎癥反應發揮其對器官損傷的保護作用［14］。本實驗中丹參酮ⅡA 能夠提高CVB3 誘導的心肌細胞抗氧化酶SOD 和GSH-Px 活性，降低MDA 的含量，減輕心肌細胞的氧化應激損傷。此外，丹參酮ⅡA 可降低CVB3 誘導的心肌細胞分泌的炎性因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平，降低炎癥反應，本實驗結果與以上研究相符。一項研究顯示，丹參酮ⅡA 可通過降低TLR4-MyD88-NF-κB 信號通路，對脂多糖誘導的RAW264.7 細胞發揮抗炎作用［15］。另一項研究發現，丹參酮IIA 通過TLR-4 介導的NF-κB信號通路降低炎性細胞因子和氧化應激水平的產生，改善缺氧缺血性腦病［16］。本實驗結果發現，丹參酮IIA 可下調CVB3 誘導的心肌細胞中TLR4 和NF-κB 蛋白表達。表明丹參酮IIA 能夠抑制TLR4/NF-κB 信號通路的激活。

總之，丹參酮ⅡA 能夠改善CVB3 誘導心肌細胞氧化應激損傷及炎癥反應，減少細胞凋亡，其潛在的機制可能與抑制TLR4/NF-κB 信號通路的活化有關。后續實驗將對丹參酮ⅡA 在病毒性心肌炎小鼠心臟的影響進一步探究，以期為病毒性心肌炎的臨床治療提供實驗基礎。