1株野生高大環(huán)柄菇的鑒定、生物學(xué)特性及仿野生栽培

劉瀟文， 陳潤(rùn)臣， 徐 晨， 王鴻磊， 王紅艷， 丁 強(qiáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺(tái)研究院， 山東 煙臺(tái) 264670)

0 引言

【研究意義】野生食用菌具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，越來越受到人們的重視。目前大多數(shù)野生食用菌主要依賴于野外采集，隨著野生食用菌需求量的逐年增加，造成野生菌的過度開采，嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境[1-3]，故野生菌人工馴化勢(shì)在必行。【前人研究進(jìn)展】高大環(huán)柄菇(Macrolepiotaprocera)也稱為高腳環(huán)柄菇、高柄環(huán)菇、棉花菇等，國(guó)外別稱陽(yáng)傘蘑菇，屬于擔(dān)子菌門層菌綱傘菌目蘑菇科大環(huán)柄菇屬。其子實(shí)體較大，最高可達(dá)30～40 cm，廣泛分布于溫帶地區(qū)[4-6]。高大環(huán)柄菇質(zhì)地脆嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，人體必需氨基酸含量高，是一種很有開發(fā)前景的野生食用菌[7]。在歐洲高大環(huán)柄菇是一種很受歡迎的食用菌，在國(guó)內(nèi)僅有零星栽培報(bào)導(dǎo)[8-10]。【研究切入點(diǎn)】目前對(duì)高大環(huán)柄菇的子實(shí)體形態(tài)特征、菌種生物學(xué)性質(zhì)、栽培特性等缺乏系統(tǒng)研究，且尚無大規(guī)模人工栽培的記錄。關(guān)于其他方面的報(bào)道也甚少[11]，偶有關(guān)于菌絲生長(zhǎng)條件的相關(guān)研究，其研究方面也不甚全面，對(duì)于大規(guī)模栽培而言參考不夠[12]。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用形態(tài)學(xué)和分子學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)2016年9月采集的1株高大環(huán)柄菇屬真菌子實(shí)體進(jìn)行鑒定，采用單因素試驗(yàn)，以菌絲生長(zhǎng)量為指標(biāo)研究其生物學(xué)特性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行仿野生栽培，以期為豐富山東省食用菌栽培品種，實(shí)現(xiàn)高大環(huán)柄菇的人工栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 2016年9月采集于煙臺(tái)市高新區(qū)林地內(nèi)，于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院食用菌實(shí)驗(yàn)室分離保藏，編號(hào)為EF-5。

1.1.2 試劑 大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨、(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、KNO3、紅糖、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、糖蜜、纖維素、KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等，市購(gòu)。

1.1.3 其他 ITS通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司；土豆浸粉、瓊脂、麥粒、麩皮、木屑、玉米芯及石灰，市購(gòu)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

1) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)。采用土豆浸粉10 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL制備。

2) 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基)。采用土豆浸粉10 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL制備。

3) 氮源培養(yǎng)基。采用蔗糖20 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后分別添加1%的大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨和0.5%的硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀等制成不同氮源培養(yǎng)基備用。

4) 碳源培養(yǎng)基。采用土豆浸粉10 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后分別添加2%的紅糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、糖蜜、纖維素和蔗糖等制成不同碳源培養(yǎng)基備用。

5) 無機(jī)鹽培養(yǎng)基。采用糖蜜20 g，土豆浸粉10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后分別添加0.1%的KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等制成不同無機(jī)鹽培養(yǎng)基備用，以不加無機(jī)鹽的培養(yǎng)基做對(duì)照。

6) 二級(jí)種培養(yǎng)基。采用麥粒90%、麩皮10%制備。

7) 栽培培養(yǎng)基。參照文獻(xiàn)[13]的方法采用木屑50%、玉米芯38%、麩皮10%、石灰2%配制栽培培養(yǎng)基，含水量65%。

1.2.2 菌株鑒定

1) 形態(tài)學(xué)觀察和菌種分離。參照文獻(xiàn)[12-14]的方法，于煙臺(tái)市高新區(qū)林地內(nèi)發(fā)現(xiàn)高大環(huán)柄菇子實(shí)體1個(gè)，拍攝子實(shí)體、菌褶等照片。采集子實(shí)體，取菌蓋和菌柄連接處的菌肉組織，接種于PDA培養(yǎng)基平板上，24℃培養(yǎng)得到高大環(huán)柄菇菌種。

2) 分子生物學(xué)鑒定。參照文獻(xiàn)[15-20]的方法，將高大環(huán)柄菇菌種接種至PDB培養(yǎng)基中，150 r/min，24℃培養(yǎng)10 d。取適量菌絲體液氮研磨，利用CTAB法提取基因組DNA，再利用真菌ITS通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增高大環(huán)柄菇基因組ITS序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送生工生物(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。采用NCBI的BLAST比對(duì)真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，獲取相似性較高的菌株，用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生物學(xué)特性觀察及指標(biāo)測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15-17]的方法研究菌株的生物學(xué)性質(zhì)。

1)菌落和菌絲形態(tài)特征。將高大環(huán)柄菇菌種接種至PDA培養(yǎng)基平板上，24℃培養(yǎng)6 d后觀察菌落形態(tài)特征并拍照。另將高大環(huán)柄菇菌種接種至PDA培養(yǎng)基平板上，在距接種塊1.5 cm處斜插1片蓋玻片，24℃培養(yǎng)5 d。取1片潔凈載玻片，滴1滴美蘭染色液，將蓋玻片有菌絲一面蓋到染色液處，顯微鏡觀察菌絲形態(tài)特征。

2) 菌絲生長(zhǎng)溫度。菌絲培養(yǎng)溫度設(shè)7個(gè)處理，即5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。用Φ8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于PDA培養(yǎng)基平板表面，然后置于不同溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)8 d測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)量(下同)。

菌絲生長(zhǎng)量=(菌落直徑-接種塊直徑)/2。

3) 菌絲生長(zhǎng)pH。根據(jù)菌絲培養(yǎng)pH不同，設(shè)8個(gè)處理，即pH為4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。按試驗(yàn)要求制備相應(yīng)pH的PDA培養(yǎng)基平板，用Φ8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于不同pH的PDA平板中央，24℃培養(yǎng)8 d，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)量。

4) 菌絲生長(zhǎng)氮源。按照添加氮源不同，設(shè)9個(gè)處理，每種氮源1個(gè)處理，即大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、土豆浸粉、胰蛋白胨和硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀等。用Φ8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，分別接種于各氮源培養(yǎng)基表面，25℃培養(yǎng)8 d，測(cè)量菌落直徑并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)量。

5) 菌絲生長(zhǎng)碳源。按照添加碳源不同，設(shè)8個(gè)處理，每種碳源1個(gè)處理，即紅糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、糖蜜、纖維素和蔗糖等。菌絲接種、培養(yǎng)及測(cè)定方法同上。

6) 菌絲生長(zhǎng)無機(jī)鹽。按照添加無機(jī)鹽不同，設(shè)10個(gè)處理，每種無機(jī)鹽1個(gè)處理，即KH2PO4、K2HPO4、CaSO4、K2SO4、MgSO4、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、FeSO4和NaCl等，以不加無機(jī)鹽為對(duì)照。菌絲接種、培養(yǎng)及測(cè)定方法同上。

1.2.4 栽培試驗(yàn) 將高大環(huán)柄菇菌母種接種至二級(jí)種培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)直至長(zhǎng)滿。取二級(jí)種接種到栽培培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至長(zhǎng)滿菌袋。將菌袋脫去，埋入毛櫻桃林內(nèi)進(jìn)行仿野生栽培。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用R語(yǔ)言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖，利用MEGA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 高大環(huán)柄菇的形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 從圖1看出，高大環(huán)柄菇子實(shí)體近白色，菌蓋直徑約8.5 cm，上覆有棕褐色鱗片，呈同心圓狀排列，中央乳頭狀凸起，褐色。菌柄中生，長(zhǎng)8.2 cm，直徑0.8 cm，棕黃色，較細(xì)長(zhǎng)，較韌，上有雙層移動(dòng)菌環(huán)。菌褶近白色，不等長(zhǎng)，靠外緣處曲折，其余部分平直，離生，孢子印白色。菌落不規(guī)則圓形，灰白色。菌絲多分枝，具鎖狀聯(lián)合。

注：A子實(shí)體，B菌蓋正面，C菌環(huán)，D菌褶，E菌落，F(xiàn)菌絲和鎖狀聯(lián)合。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 該真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約700 bp，登陸NCBI，用BLAST程序比對(duì)測(cè)序結(jié)果，獲取相似性較高的高大環(huán)柄菇30654(Macrolepiotaprocera30654)、白大環(huán)柄菇 YSU-1(MacrolepiotapuellarisYSU-1)、長(zhǎng)柄大環(huán)柄菇 MFLU121764(MacrolepiotadolichaulaMFLU121764)等菌株，構(gòu)建獲得系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，該菌株(EF-5)與高大環(huán)柄菇菌株30654遺傳距離達(dá)99%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征鑒定其為高大環(huán)柄菇(Macrolepiotaprocera)。

圖2 高大環(huán)柄菇EF-5系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 高大環(huán)柄菇的生物學(xué)特征

從圖3看出，不同生長(zhǎng)條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響存在差異。

2.2.1 溫度 隨著培養(yǎng)溫度升高，高大環(huán)柄菇菌株EF-5的菌絲生長(zhǎng)量呈先升后降趨勢(shì)，培養(yǎng)8 d后菌絲生長(zhǎng)量為0.275 0～29.925 0 mm，表現(xiàn)為25℃>30℃>20℃>35℃>15℃>10℃>5℃。當(dāng)培養(yǎng)溫度低于15℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)量緩慢增加；當(dāng)培養(yǎng)溫度超過15℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)量迅速提高；當(dāng)溫度達(dá)25℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)量達(dá)最高，為29.925 0 mm；繼續(xù)提高培養(yǎng)溫度，菌絲生長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)，當(dāng)溫度增至35℃時(shí)，菌絲仍能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)很慢。

2.2.2 pH 高大環(huán)柄菇菌株EF-5菌絲生長(zhǎng)pH范圍較寬，pH 4.5～11.0均能生長(zhǎng)，隨著環(huán)境pH增加，高大環(huán)柄菇菌絲生長(zhǎng)量呈先升后降趨勢(shì)，菌絲生長(zhǎng)量為16.060 0～31.678 3 mm，表現(xiàn)為pH8.0>pH9.0>pH7.0>pH10.0>pH6.0>pH5.0>pH11.0>pH4.5。當(dāng)pH<8.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)量呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH 8.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)量達(dá)最大；當(dāng)pH>8.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)量呈下降趨勢(shì)。

2.2.3 氮源 高大環(huán)柄菇菌株EF-5在無機(jī)氮源和有機(jī)氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，菌絲生長(zhǎng)量為9.926 7～33.441 7 mm，表現(xiàn)為土豆浸粉>大豆蛋白胨>酵母膏>胰蛋白胨>蛋白胨>硫酸銨>硝酸鉀>氯化銨>硝酸銨。菌絲對(duì)有機(jī)氮源的利用明顯好于無機(jī)氮源。其中，菌絲在以土豆浸粉為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，菌絲生長(zhǎng)量為33.441 7 mm，顯著高于除大豆蛋白胨和酵母膏處理外的其余處理；大豆蛋白胨與酵母膏處理菌絲生長(zhǎng)量分別為31.605 0 mm和30.456 7 mm，差異不顯著，但均顯著高于除胰蛋白胨和蛋白胨處理外的其余處理；硝酸銨處理菌絲生長(zhǎng)最慢，顯著低于除氯化銨處理外的其余處理。

注：圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2.4 碳源 碳源可為高大環(huán)柄菇EF-5菌絲生長(zhǎng)提供碳元素和能量，是菌絲生長(zhǎng)需求量最大的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。高大環(huán)柄菇菌株EF-5菌絲在各種碳源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其菌絲生長(zhǎng)量為16.038 3～32.206 7 mm，表現(xiàn)為糖蜜>葡萄糖>麥芽糖>纖維素>可溶性淀粉>紅糖>蔗糖>乳糖。其中，以糖蜜作為碳源時(shí)的菌絲生長(zhǎng)量最高，與其余7種碳源間差異顯著，為高大環(huán)柄菇EF-5菌絲生長(zhǎng)最佳碳源；葡萄糖和麥芽糖其次，菌絲生長(zhǎng)量分別為32.206 7 mm和31.586 7 mm，均顯著高于除糖蜜處理外的其余碳源處理；菌絲在以乳糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，顯著低于其余碳源處理。

2.2.5 無機(jī)鹽 無機(jī)鹽具有維持細(xì)胞滲透壓、保持細(xì)胞內(nèi)酶活性等重要物質(zhì)，是微生物生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)元素。高大環(huán)柄菇菌株EF-5菌絲在各種無機(jī)鹽培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其菌絲生長(zhǎng)量為27.377 5～34.530 0 mm，表現(xiàn)為MnSO4>CaSO4>K2SO4>FeSO4>K2HPO4>Na2SO4>NaCl>CK>ZnSO4>KH2PO4>MgSO4。10種無機(jī)鹽中，MnSO4、CaSO4、K2SO4、FeSO4和K2HPO4具有明顯的促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的作用，其相互間差異不顯著，但MnSO4、CaSO4和K2SO4處理菌絲生長(zhǎng)量顯著高于除FeSO4和K2HPO4外的其余處理；FeSO4和K2HPO4處理菌絲生長(zhǎng)量顯著高于除Na2SO4外的其余處理；Na2SO4處理菌絲生長(zhǎng)量顯著高于MgSO4處理，但與其余處理差異不顯著；其余處理間差異不顯著。在促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的5種無機(jī)鹽中，以硫酸錳的菌絲生長(zhǎng)量最大，菌絲最為濃密，為高大環(huán)柄菇EF-5菌絲生長(zhǎng)最佳無機(jī)鹽。

2.3 仿野生栽培

從圖4看出，將高大環(huán)柄菇EF-5母種接種到二級(jí)種培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)大約60 d菌絲長(zhǎng)滿菌種瓶。將二級(jí)種接種到栽培料，第2天菌種即萌發(fā)，第8天基本封面，經(jīng)66 d培養(yǎng)基本長(zhǎng)滿栽培袋，繼續(xù)培養(yǎng)14 d進(jìn)行后熟。脫袋后埋入毛櫻桃林中，61 d開始陸續(xù)現(xiàn)蕾，菇蕾初為球形，后菌蓋與膨大的菌柄基部逐漸分離，菌柄拉長(zhǎng)將菌蓋托起。當(dāng)菌柄伸長(zhǎng)，菌蓋尚未展開時(shí)采收。栽培狀態(tài)下的高大環(huán)柄菇EF-5可長(zhǎng)至22 cm長(zhǎng)，單個(gè)菇重超過100 g。

注：A為二級(jí)種，B為長(zhǎng)滿的栽培袋，C田間栽培(埋入地下)，D菇蕾，E幼菇，F(xiàn)采摘的成熟菇。

3 討論

探索了高大環(huán)柄菇EF-5菌株子實(shí)體形態(tài)特征和生長(zhǎng)條件，并通過仿野生栽培成功獲得了子實(shí)體。該研究篩選出的最佳溫度、氮源及發(fā)菌時(shí)間等與前人結(jié)果均有差別，究其原因是不同地區(qū)的氣候、土壤不同或菌種的特性不同所致。

高大環(huán)柄菇屬于新興食用菌，相關(guān)研究剛起步，很多生物學(xué)性質(zhì)并不清楚。該研究雖然成功獲得子實(shí)體，但也發(fā)現(xiàn)在試驗(yàn)栽培過程中仍存在很多問題。首先，二級(jí)種生長(zhǎng)緩慢。高大環(huán)柄菇二級(jí)種的培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60 d(750 mL菌種瓶)，遠(yuǎn)長(zhǎng)于平菇、香菇等食用菌，且菌種培養(yǎng)后期產(chǎn)生大量黃水。其次，栽培周期長(zhǎng)。高大環(huán)柄菇接種至栽培料到菌絲成熟需要80 d，覆土至現(xiàn)蕾需要61 d，從接種到現(xiàn)蕾的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)141 d，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過常規(guī)栽培的食用菌品種。第三，出菇條件不清楚，產(chǎn)量低。經(jīng)過1年的試驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)室無法獲得子實(shí)體，經(jīng)仿野生栽培雖然獲得子實(shí)體，但總產(chǎn)量較低。由于存在以上幾方面的問題，高大環(huán)柄菇大規(guī)模人工栽培尚需時(shí)日。今后需進(jìn)一步對(duì)二級(jí)種培養(yǎng)基和栽培培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以縮短栽培時(shí)間提高產(chǎn)量；同時(shí)，需要研究高大環(huán)柄菇的出菇條件和采摘條件，以實(shí)現(xiàn)工廠化可控栽培。

4 結(jié)論

對(duì)采自野外的1株大環(huán)柄菇屬真菌(編號(hào)EF-5)通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，最終確定其為高大環(huán)柄菇。其菌絲生長(zhǎng)最佳條件：氮源為土豆浸粉，碳源為糖蜜，生長(zhǎng)溫度為25℃，生長(zhǎng)pH為8，無機(jī)鹽為硫酸錳。此真菌菌種在麥粒二級(jí)種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)時(shí)間為60 d，接種栽培料后66 d長(zhǎng)滿菌袋，經(jīng)仿野生栽培成功收獲子實(shí)體。