負(fù)載ZnO的羧甲基纖維素原位修飾細(xì)菌纖維素的合成及其抗菌活性

馮 勁， 施慶珊， 謝小保

廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070

納米氧化鋅具有較好的抗菌性能，同時被認(rèn)為是低毒，環(huán)保，具有較好的生物安全性[1]。細(xì)菌纖維素(BC)是由某些醋桿菌生產(chǎn)的多糖，其在分子結(jié)構(gòu)上與植物纖維素相同[2]。然而，BC在一些物理性質(zhì)優(yōu)于植物纖維，包括高強(qiáng)度的機(jī)械性能，高純度，高持水能力，良好的生物相容性，超細(xì)的纖維和三維纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。以上的優(yōu)異的性能使BC比植物纖維更適合應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料和高端工業(yè)原料，如人造皮膚，組織置換材料，導(dǎo)電碳膜和超濾膜等[3,4]。但是BC是葡萄糖聚合而成，容易滋生微生物。載納米金屬顆粒的BC，就可以使BC具有抗菌性能。現(xiàn)時，制備載納米金屬顆粒的BC主要有兩種方法。第一種方法，直接將BC浸入納米金屬溶液或金屬鹽溶液，再經(jīng)反應(yīng)制備得到制備載納米金屬顆粒的BC[5,6]。但是納米顆粒只是靠BC的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)將金屬顆粒截留在BC中，結(jié)合量少且容易脫落。第二種方法，通過化學(xué)改性將BC的纖維素帶上羧基或胺基的官能團(tuán)，通過離子交換結(jié)合上金屬離子，再通過反應(yīng)制備出載納米金屬顆粒的BC[7,8]。這種方法明顯提高納米顆粒載入量，但是過程繁復(fù)。本研究通過BC發(fā)酵過程中添加羧甲基纖維素(CMC)，在纖維素合成的過程中與羧甲基纖維素發(fā)生氫鍵結(jié)合，使BC帶上羧基，再與鋅離子進(jìn)行離子交換反應(yīng)制備出負(fù)載ZnO的羧甲基纖維素原位修飾細(xì)菌纖維素。這種方法比化學(xué)改性方法簡單，方便。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：GluconacetobacterintermediusBC-1由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC8739、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538p和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC21332均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 BC和BC/CMC生物復(fù)合材料的發(fā)酵制備

菌株BC-1 于SH培養(yǎng)基(葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母5 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.7 g/L，檸檬酸1.5 g/L，pH 5.0)在28 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，將10 mL種子液接入裝有190 mL A9培養(yǎng)基(葡萄糖40 g/L，酵母1 g/L，蛋白胨7 g/L，Na2HPO4·12H2O 8 g/L，玉米漿6 g/L，乙酸1mL/L，乙醇14 mL/L，pH 6.0)的300 mL三角瓶中。隨后，將接種的培養(yǎng)基分裝入24孔板(每孔1.5 mL)，然后在28 ℃靜止培養(yǎng)10 d。制備BC/CMC生物復(fù)合物，添加0.5%CMC(MW 700 kD，DS 0.9；MW 250 kD，DS 0.9或MW 250 kD，DS 1.2)。孵育后，將BC和BC/CMC生物復(fù)合物用蒸餾水沖洗兩次，以除去殘留的培養(yǎng)基。隨后，用0.1 mol/L NaOH溶液沸水浴處理15 min。最后，將膜用純凈水洗滌數(shù)次直至中性pH。根據(jù)添加到A9培養(yǎng)基中的CMC的分子量(MW)和取代度(DS)，標(biāo)記樣品如下：BC/CMC70w0.9，BC/CMC25w0.9和BC/CMC25w1.2。

1.3 負(fù)載BC或BC/CMC生物復(fù)合材料的ZnO納米顆粒的制備

將BC和BC/CMC(12片)分別在30 ℃的15 mL 0.001 mol/L醋酸鋅溶液中浸泡過夜，然后用蒸餾水徹底沖洗。將鋅離子交換樣品浸入20 mL 0.5 mol/L NaOH溶液和0.25 mL的乙二胺溶液中。立即對其進(jìn)行超聲處理30 min。超聲處理后，將溶液在30 ℃振蕩24 h。之后，用蒸餾水徹底清洗膜，直到清洗液的pH為中性為止。

1.4 納米復(fù)合材料的表征

使用VERTEX 70光譜儀(Bruker，德國)在400～3 700 cm-1范圍內(nèi)以1 cm-1的分辨率獲得了樣品的傅立葉紅外(FTIR)光譜。通過使用Hitachi H-3000 N掃描電子顯微鏡觀察SEM圖像。XRD圖譜由D8 ADVANCE多晶X射線衍射儀(德國布魯克)，掃描速率為5.0 °/min，電壓為40 kV，電流為40 mA時拍攝。結(jié)晶度(結(jié)晶度指數(shù)，CrI)是根據(jù)SEGAL等人的方法由衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)計算得到的。CrI(%)=(1—(IAM/I200))×100%。IAM和I200分別表示相同單位在大約2θ= 18°處的衍射強(qiáng)度和(002)晶格衍射的最大強(qiáng)度在大約2θ= 22.7°處[9]。使用Multiskan GO Reader(Thermo Fisher科學(xué)公司，美國)記錄紫外可見光譜。通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS，安捷倫7700，日本)確定負(fù)載BC或BC/CMC生物復(fù)合物的ZnO納米顆粒中Zn的濃度。使用動態(tài)光散射(DLS)Zetasizer Pro(英國馬爾文)確定樣品中ZnO納米顆粒的粒徑分布。

1.5 持水量(WHC)和補(bǔ)水率

將濕的BC和BC/CMC生物復(fù)合物7 000 r/min離心10 min，稱重沉淀物(Wwet)。然后將沉淀物冷凍干燥并稱重(Wdry)。BC和BC/CMC生物復(fù)合材料持水量的相關(guān)計算公式如下：WHC =(Wwet-Wdry)/Wdry。將冷凍干燥的BC和BC/CMC生物復(fù)合材料在室溫下浸入去離子水中24 h。將再水合的樣品以7 000 r/min離心10 min，然后稱重沉淀物(Wrwet)。BC和BC/CMC生物復(fù)合材料持水率的相關(guān)計算公式如下：復(fù)水率=(Wrwet-Wdry)/(Wwet-Wdry)[10]。

1.6 羧基含量的測定

BC和BC/CMC生物復(fù)合物的羧酸鹽含量通過電導(dǎo)滴定法測定。用均質(zhì)器破碎BC和BC/CMC生物復(fù)合物制備成漿狀。冷凍干燥的樣品(30 mg～40 mg)懸浮在15 mL的0.01 mol/L鹽酸溶液中，并充分?jǐn)嚢枋蛊涑浞址稚ⅰＲ?.1 mL/min的速度添加0.01 mol/L NaOH溶液，直到pH達(dá)到9。pH和電導(dǎo)率每分鐘記錄一次。根據(jù)電導(dǎo)率和pH曲線確定樣品中的羧酸鹽含量[11]。

1.7 抗菌活性

抗菌活性測試是在營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)皿中進(jìn)行。將樣品膜切成直徑為6 mm的圓盤狀。滅菌后，將圓片分別置于含有約106CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的瓊脂平板上。于37±1 ℃孵育24 h。測量了圓片周圍形成的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與討論

2.1 BC/CMC生物復(fù)合材料的表征

BC，BC/CMC生物復(fù)合物和CMC(MW 250 kD，DS 1.2)的FTIR-ATR光譜，如圖1所示。可以看出BC在1 500 cm-1～2 000 cm-1處沒有明顯的吸收帶(圖1B)。在圖1B中，BC/CMC生物復(fù)合物和CMC(MW 250 kD，DS 1.2)，出現(xiàn)了一個歸因于羰基的1 598 cm-1附近的吸收帶[12]。這表明CMC纖維可以引入BC納米纖維。這表明BC/CMC生物復(fù)合物成功地帶有羧基。

a: BC；b:BC/CMC70w0.9; c: BC/CMC25w0.9; d: BC/CMC25w1.2; e: CMC(MW 250 kD，DS 1.2)

表1中顯示了BC和BC/CMC生物復(fù)合物的羧基含量。觀察到，純BC，BC/CMC70w0.9，BC/CMC25w0.9和BC/CMC25w1.2的羧基含量分別為0.065 mmol/g、0.102 mmol/g、0.111 mmol/g和0.149 mmol/g。BC/CMC生物復(fù)合物比BC的羧基含量略有增加。這結(jié)果接近于FTIR-ATR結(jié)果。CMC的取代度(DS)高可能導(dǎo)致BC/CMC生物復(fù)合物中羧基含量的增加。CMC的分子量對BC/CMC生物復(fù)合物中的羧基含量沒有影響。

表1 BC和BC/CMC生物復(fù)合物的羧基含量

圖2 BC，BC/CMC生物復(fù)合物的XRD圖

表2 BC，BC/CMC生物復(fù)合物的結(jié)晶度

通過SEM觀察到BC和BC/CMC生物復(fù)合物的形態(tài)分析(圖3)。所有樣品均顯示出相似的納米孔三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。BC樣品的纖維網(wǎng)絡(luò)比BC/CMC生物復(fù)合物致密。BC/CMC生物復(fù)合材料的納米纖維帶比BC寬。添加的CMC的分子量越高，其纖維網(wǎng)絡(luò)越致密。

a：BC，b：BC/CMC70w0.9；c：BC/CMC25w0.9；d：BC/CMC25w1.2

表3顯示了BC和BC/CMC生物復(fù)合材料的持水量和回復(fù)水率的結(jié)果。BC和BC/CMC70w0.9持水量的結(jié)果相差不大。而它們的持水量大于BC/CMC25w0.9和BC/CMC25w1.2。因?yàn)槊芗睦w維網(wǎng)絡(luò)可以防止離心過程中水從纖維網(wǎng)絡(luò)中流出，這與SEM結(jié)果一致。BC/CMC生物復(fù)合材料的回復(fù)水率比大于BC。這與XRD的結(jié)果一致。CMC增加了BC生物復(fù)合材料的無定形區(qū)的比例，使BC/CMC生物復(fù)合纖維可以重新結(jié)合更多的水。BC/CMC70w0.9的復(fù)水率比大于BC/CMC25w0.9。可能是所添加的CMC具有較大的分子量，從而增加了培養(yǎng)基的粘度，從而使纖維在發(fā)酵過程中形成了更加多孔的結(jié)構(gòu)，這對吸水是有利的。BC/CMC25w1.2的復(fù)水率也大于BC/CMC25w0.9。這可能是CMC中更多的羧基與發(fā)酵纖維的羥基結(jié)合，從而減少了纖維中羥基之間氫鍵的形成。它使結(jié)構(gòu)松散，以便重新吸收更多的水。這可以從SEM圖像中觀察到這一推論(圖3c和圖3d)。

表3 BC和BC/CMC生物復(fù)合材料的持水量和回復(fù)水率的結(jié)果

2.2 BC/CMC生物復(fù)合材料的負(fù)載納米ZnO的表征

圖4顯示了BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO的X射線衍射圖。圖中分別位于31.8°，34.4°，36.3°，47.6°，56.6°，62.8°，66.3°，67.9°，72.6°，76.9°，81.3°，89.6°，92.7°，95.2°和98.5°的16個衍射峰分別對應(yīng)為(100)，(002)，(101)，(102)，(110)，(103)，(200)，(112)，(201)，(004)，(202)，(104)，(203)，(210)，(211)和(114)的ZnO晶面(JCPDS No.36-1451)。衍射峰23.0°對應(yīng)于纖維素I的(002)晶面。它證明了ZnO成功負(fù)載上BC或BC/CMC生物復(fù)合材料上。

圖4 BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO的X射線衍射圖

BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO的UV-Vis吸收光譜如圖5所示。所有樣品在360 nm處觀察到最大值。這是納米ZnO顆粒的典型吸收，它與ZnO納米顆粒表面上的導(dǎo)電電子(或自由電子)的表面等離振子共振(SPR)有關(guān)。表明納米ZnO成功負(fù)載上BC或BC/CMC生物復(fù)合材料上SPR峰是受納米顆粒的形狀和大小的影響的[14]。是否添加CMC，添加的CMC的Mw和DS對合成的ZnO納米粒子的形貌和粒徑?jīng)]有影響。

圖5 BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO的UV-Vis吸收光譜

測得ZnO-BC，ZnO-BC/CMC70w0.9，ZnO-BC/CMC25w0.9和ZnO-BC/CMC25w1.2的ZnO含量分別為45.56%，52.74%，54.57%和55.72%。這意味著生物復(fù)合物中羧基的含量越高，ZnO的負(fù)載量就越大。

用DLS分析了BC或BC/CMC生物復(fù)合物上形成的ZnO NPs的大小分布(圖6)。在BC或BC/CMC生物復(fù)合物中，ZnO NPs的粒徑分布較窄ZnO-BC，ZnO-BC/CMC70w0.9，ZnO-BC/CMC25w0.9和ZnO-BC/CMC25w1.2的z平均粒徑和多分散指數(shù)(PI)分別為193.4 nm(PI = 0.2797)，194.1 nm(PI = 0.2778)，184.1 nm(PI = 0.3219)和195.4 nm(PI = 0.3203)。載體中的羧基對合成的ZnO的粒徑?jīng)]有影響。

圖6 BC或BC/CMC生物復(fù)合物上形成的ZnO納米顆粒的直徑大小分布

SEM分析負(fù)BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO的形態(tài)(圖7)。ZnO-BC，ZnO-BC/CMC70w0.9和ZnO-BC/CMC25w0.9中的ZnO納米顆粒團(tuán)聚成球并分布在纖維中(圖7a、圖7b和圖7c)。相反，ZnO-BC/CMC25w1.2中的ZnO納米顆粒沒有團(tuán)聚。它們松散地分布在光纖中(圖7 d)。纖維中的羧基會阻止ZnO納米粒子的團(tuán)聚。

a：ZnO-BC；b：ZnO-BC/CMC70w0.9；c：ZnO-BC/CMC25w0.9；d：ZnO-BC/CMC25w1.2

2.3 BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO的抗菌活性

通過擴(kuò)散法測試了BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性。圖8所示為BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO的抗菌圈，結(jié)果列于表4。BC，BC/CMC70w0.9，BC/CMC25w0.9和BC/CMC25w1.2沒有抗菌活性，BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO抗菌能力主要由納米ZnO提供。ZnO-BC/CMC70w0.9和ZnO-BC/CMC25w1.2的抗菌性能優(yōu)于ZnO-BC和ZnO-BC/CMC25w0.9。

a:大腸桿菌；b:金黃色葡萄球菌；c:枯草芽孢桿菌；1：ZnO-BC；2：BC；3：ZnO-BC/CMC70w0.9；4：BC/CMC70w0.9；5：ZnO-BC/CMC25w0.9；6：BC/CMC25w0.9；7：ZnO-BC/CMC25w1.2；8：BC/CMC25w1.2

表4 BC或BC/CMC生物復(fù)合物負(fù)載納米ZnO的抗菌圈的邊緣距大小(mm)

3 結(jié)論

添加不同分子量和取代度的CMC對發(fā)酵所得BC/CMC的性能產(chǎn)生影響。添加的高取代度的CMC可能導(dǎo)致BC/CMC生物復(fù)合物中羧基含量的增加，卻提高材料的結(jié)晶度。添加的CMC的分子量越高，其纖維網(wǎng)絡(luò)越致密，使BC/CMC70w0.9的持水能力和復(fù)水率都優(yōu)于BC，BC/CMC25w1.2和BC/CMC25w0.9。在發(fā)酵過程中添加CMC，能有效提高BC負(fù)載納米氧化鋅的量。添加的CMC的取代度高可能導(dǎo)致BC/CMC生物復(fù)合物中羧基含量的增加，同時阻止ZnO納米粒子的團(tuán)聚。ZnO-BC/CMC70w0.9和ZnO-BC/CMC25w1.2的抗菌性能優(yōu)于ZnO-BC和ZnO-BC/CMC25w0.9。ZnO-BC/CMC25w0.9與ZnO-BC抗菌能力沒有差異。這些結(jié)果表明在BC發(fā)酵過程中添加CMC能成功引入羧基基團(tuán)，并且能有效提高載入ZnO能力。這為細(xì)菌纖維素與納米顆粒開發(fā)抗菌材料提供新思路。