紅花注射液中蛋白類成分的分離、純化與細胞致敏性評價

史傳林 李方林 丁選勝

（中國藥科大學基礎醫學與臨床藥學學院，江蘇 南京 211198）

紅花注射液是由單位藥材紅花制成的活血化瘀類注射液，對腦血管疾病、冠心病、脈管炎等疾病有良好的療效[1-2]。隨著其廣泛的臨床應用，國家食品藥品監督管理總局多次對紅花注射液引發的過敏反應進行通報[3-4]。周彬等[5]從紅花注射液中分離出大分子抗原活性雜質，進行豚鼠ASA試驗和大鼠PCA試驗，結果表明制劑中的殘留蛋白或許是引起紅花注射液過敏反應發生的主要因素。中藥注射劑過敏反應高發的因素之一就是其化學成分復雜，致敏成分不明確，包括紅花注射液在內的大部分中藥注射劑在上市前進行的研究并不足以預防其過敏反應的發生，因此對紅花注射液中的致敏原進行分離、純化及致敏性研究，是保證其臨床安全應用亟需解決的問題之一。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及儀器

1.1.1 主要實驗材料 大鼠嗜堿性細胞白血病細胞（RBL-2H3），購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。紅花注射液，華潤三九（雅安）藥業有限公司，批號16030 402001；DEAE-52 樹脂，博美生物科技有限公司，批號BQDE52-100g；Sephadex G-100樹脂，博美生物科技有限公司，批號PJTG100-100g；彩色預染超低分子量marker，博士德生物工程有限公司，批號12D07A17；山羊抗大鼠二抗（HRP標記），碧云天，批號110917 180229；紅花注射液大鼠致敏血清，實驗室自制，批號20170511。

1.1.2 主要試驗儀器 分析天平（1/10 000），北京賽多利斯儀器系統有限公司，型號BS124S；垂直電泳Bio-Rad系列，美國Bio-Rad；全自動酶標儀，美國Thermo公司，型號Multiskan GO；紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司，型號N4S；化學發光凝膠拍攝儀，上海天能科技有限公司，型號5200Multi。

1.2 實驗方法

1.2.1 DEAE-52層析實驗[6]預處理好的DEAE-52先用0.02 mol/L的TBS（pH 8.5）洗滌平衡，然后超聲波真空脫氣20 min備用。層析柱（柱高30 cm，直徑3 cm）先用0.02 mol/L的TBS液（pH 8.5）浸潤，底部塞入無菌脫脂棉后加入約1 cm的0.02 mol/L TBS（pH 8.5）緩沖液，傾斜層析柱，緩緩倒入攪拌均勻的DEAE-52樹脂，進行裝柱。平衡層析柱后，用滴管吸取紅花注射液沿層析柱壁環繞上樣。依次以0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS（pH 8.5）洗脫液各200 mL進行分段梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，分管收集洗脫液，5 mL/管。紫外分光光度計檢測280 nm處分管收集的洗脫液的吸光度。

1.2.2 Sephadex G-100凝膠層析[7]將預處理好的Sephadex G-100凝膠漿狀物進行裝柱并平衡。取0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫液蛋白樣品，混勻后備用。用移液管加樣，使樣品沿柱內壁加入，邊加邊沿柱內壁轉動1周，然后移至中心，使樣品盡快分布于表面。待樣品全部進入床內，用少許0.02 mol/L TBS（pH 8.5）緩沖液沖洗柱內壁和床表面2次，注意不要破壞床表面平整。用0.02 mol/L TBS（pH 8.5）-0.01 mol/mL NaCl緩沖液洗脫5倍柱床體積，洗脫速度為0.25 mL/min。收集洗脫液，每管5 mL。用紫外分光光度計動態檢測洗脫液在280 nm處吸光度。

1.2.3 Tricine-SDS-PAGE分析 將紅花注射液蛋白成分與Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液（1∶1）混合，沸水煮5 min，冷卻后低溫保存備用。用移液槍分別吸取處理好的樣品30 μL，并在最外側泳道加入彩色預染超低分子量標準5 μL，加樣完畢后，即開始電泳。電泳完畢后剝開膠板，剝去濃縮膠部分，將分離膠取出置于培養皿中，倒入固定液后置水平搖床上固定30 min。將固定液倒出，加入考馬斯亮藍G-250染色液置水平搖床上輕搖1 h染色。倒出染色液，加入脫色液，過夜脫色。觀察條帶并拍照。

1.2.4 Western Blot分析 預先將合適大小的PVDF膜置于甲醇中活化5 min。待Tricine-SDS-PAGE電泳結束，直接取出凝膠剪切好后，鋪好轉膜三明治（注意不能有氣泡），移入轉移槽，加滿轉移緩沖液，加入冰塊后開始轉膜，300 mA恒流60 min。轉膜完成后，取出PVDF膜，濾紙吸干轉移緩沖液，置于封閉液（5% BAS-TBST）至完全將膜覆蓋，室溫脫色搖床上封閉2 h。待封閉完成后，將一抗（大鼠致敏血清）用5% BSATBST稀釋至適當濃度（1∶10）。PVDF膜使用一抗孵育，4 ℃，過夜孵育。一抗孵育完成后，采用TBST漂洗膜3次，每次15 min。洗膜完成后，將羊抗大鼠二抗（HRP標記）稀釋（1∶2000），PVDF膜室溫孵育1 h，孵育完成后采用TBST漂洗PVDF膜3次，每次15 min，然后采用TBS漂洗PVDF膜1次，15 min。完成免疫反應的PVDF膜采用ECL化學發光試劑進行發光檢測。

1.2.5 潛在致敏蛋白的細胞致敏性確證[8-9]將RBL-2H3細胞接種于96孔板（1×105個細胞/孔），接種體積為100 μL，每組設置5個復孔，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h。24 h后，正常血清孔、牛血清白蛋白孔、總酶孔、純化蛋白孔分別加入制備所得的大鼠致敏血清，總酶孔加入等體積MEM培養基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養24 h。24 h后，棄培養液，以PBS清洗，去除殘余血清。每孔再次分別加入100 μL BSA、純化蛋白或等體積緩沖液，總酶孔加入100 μL含0.1% TritonX-100以完全溶解細胞，37 ℃孵育1.5 h。1.5 h后，冰浴終止反應，收集培養上清，1000 r/min，4 ℃離心。收集離心后所得上清。采用微板法檢測上清中β-氨基己糖苷酶釋放率[10]：取96孔板，每孔加入上清液50 μL，基質液50 μL，混勻，37 ℃孵育1h，加入150 μL終止液終止反應，5 min內于405 nm處測定吸光值（A）。β-氨基己糖苷酶釋放率計算方法見公式1。

1.3 統計學方法 應用SPSS 22.0軟件進行數據分析，運用Graphpad Prism 6軟件進行作圖。計量資料數據以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（若方差齊，采用Bonferroni檢驗；若方差不齊，采用Dunnett's T3檢驗）。P＜0.05認為差異顯著。

2 結果

2.1 紅花注射液蛋白類成分的DEAE-52樹脂洗脫結果 為將紅花注射液蛋白類成分根據其與DEAE-52結合能力的強弱逐步洗脫下來，本實驗選擇NaCl的洗脫濃度為0.00～0.05 mol/L的NaCl-TBS（pH 8.5）進行層析洗脫。紅花注射液蛋白類成分的DEAE-52樹脂洗脫曲線見圖1。由洗脫曲線可見，NaCl-TBS洗脫液中NaCl濃度為0.00 mol/L時，基本無蛋白洗脫；當NaCl-TBS洗脫液中NaCl濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L時，得到5個明顯的洗脫峰，分別標注為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，為潛在致敏蛋白組分。

圖1 紅花注射液蛋白類成分的DEAE-52樹脂洗脫曲線

2.2 DEAE-52樹脂洗脫成分的Tricine-SDS-PAGE分析結果 將0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫液中的蛋白成分進行Tricine-SDS-PAGE凝膠分析，結果見圖2。由圖可知，在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫液中均可見明顯的蛋白條帶影，與圖1洗脫曲線顯示結果一致，并且蛋白分子量基本分布在4.6～42kD。

圖2 DEAE-52樹脂洗脫成分的Tricine-SDS-PAGE分析結果

2.3 DEAE-52樹脂洗脫成分的Western Blot分析結果 在Tricine-SDS-PAGE分析結果證實在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫液中存在蛋白的基礎上，進一步將0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫白成分進行Western blot免疫印跡分析，結果見圖3。由圖可見，在0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫成分中，僅有0.04和0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫液出現免疫印跡反應，各有一條清晰的蛋白條帶。由此說明，僅在0.04和0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫液中存在潛在致敏蛋白成分，且致敏蛋白分子量在35～48 KD。

圖3 DEAE-52樹脂洗脫液Western Blot分析結果

2.4 紅花注射液蛋白類成分的Sephadex G-100凝膠層析曲線 將0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫蛋白復溶后，進行Sephadex G-100凝膠層析。每管收集流出液5 mL，共收集200管。用紫外可見分光光度計在280 nm處實時動態檢測每管流出液的吸光度A280。0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫蛋白混合樣品的Sephadex G-100洗脫曲線見圖4。由洗脫曲線可知，0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫蛋白混合樣品在經Sephadex G-100凝膠層析后，出現兩個洗脫峰，如圖標記為A和B。峰A有明顯的前沿和拖尾，且有多個肩峰，峰B峰形良好，兩側基本對稱。由此提示，峰A分離較差，蛋白分子量較小且相近，峰B分離較好，蛋白成分單一。

圖4 0.04、0.05 mol/L洗脫蛋白混合樣品的Sephadex G-100凝膠層析曲線

2.5 Sephadex G-100凝膠分離成分的Tricine-SDS-PAGE分析結果 將0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫蛋白混合樣品進行Sephadex G-100凝膠層析后，獲得峰A和峰B，將其濃縮、透析、干燥后，分別進行Tricine-SDS-PAGE凝膠分析，結果見圖5。由圖可知，在洗脫峰A中可見一條明顯的條帶影，分子量集中4.6 kD～17 kD范圍內。洗脫峰B則僅有一條清晰的蛋白條帶，分子量在26 kD～48 kD。

圖5 Sephadex G-100層析洗脫液的Tricine-SDS-PAGE分析結果

2.6 Sephadex G-100凝膠分離成分的Western Blot分析結果 在Tricine-SDS-PAGE分析證實在洗脫峰A和洗脫峰B中存在潛在致敏蛋白成分的基礎上，進一步將洗脫峰A和洗脫峰B進行Western blot免疫印跡分析，結果見圖6。由圖可見，在洗脫峰A和洗脫峰B的潛在致敏蛋白成分中，僅有洗脫峰B出現免疫印跡反應，出現一條清晰的蛋白條帶。由此提示，僅在洗脫峰B中存在致敏蛋白成分，且致敏蛋白分子量在35-48 kD之間。

圖6 Sephadex G-100層析洗脫液的Western Blot分析結果

2.7 潛在致敏蛋白的細胞致敏性評價結果 通過測定β-氨基己糖苷酶釋放率評價Sephadex G-100層析洗脫峰A和洗脫峰B中潛在致敏蛋白成分致RBL-2H3細胞脫顆粒的效果。β-氨基己糖苷酶釋放率測定結果見圖7。與陰性對照組（10%葡萄糖溶液組）比較，陽性對照組（BSA組）和洗脫峰B蛋白組的β-氨基己糖苷酶釋放率均明顯升高，有極顯著性差異（P＜0.001），而洗脫峰A蛋白組的β-氨基己糖苷酶釋放率基本無變化（P＞0.05）。由此提示，洗脫峰B蛋白組分能引起RBL-2H3細胞明顯脫顆粒，具有致敏性，說明洗脫峰B中蛋白成分為紅花注射液潛在致敏蛋白成分。

圖7 潛在致敏蛋白的細胞致敏性評價結果

3 討論

離子交換層析是根據蛋白質所帶電荷的差異進行分離純化的一種方法。多肽中氨基酸的帶電性決定了蛋白質所帶電荷[11]。離子交換層析所用的交換劑是經化學反應引入陽性或陰性離子基團制成的，可與帶相反電荷的蛋白質進行交換吸附。帶有陽離子基團的交換劑可置換吸附帶負電荷的物質，稱為陰離子交換劑，如DEAE-52。在DEAE-52層析柱中，經不同離子強度的TBS（pH 8.5）洗脫液進行洗脫后，在臨近離子強度的洗脫液中可能存在殘留現象。因此，在本研究中檢測到0.04和0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫液中均含有致敏蛋白成分，但二者是否為同一成分，有必要開展進一步分析。凝膠層析，也稱分子排阻層析，其分離原理是依據被分離物質的分子量差異。該方法是一種比較溫和的分離方法，使用于生物蛋白類的分離[12]。凝膠顆粒是常用的固定相載體，其中各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（Sephadex）最為常用。本實驗所用葡聚糖凝膠（Sephadex G-100）層析的分離依據就是依靠樣品分子量的差異，而不依賴于改變流動相的組成。因此，選用單一緩沖液作為洗脫液即可，本實驗選擇pH 8.5的TBS緩沖液。同時，為了防止凝膠可能對帶電荷蛋白質的吸附作用，在緩沖液中需要含有一定離子強度的鹽，對蛋白質起到穩定和保護作用，因此，本實驗中選擇用0.01 mol/mL NaCl提供洗脫液所需的離子強度[13]。將含有潛在致敏蛋白的0.04、0.05 mol/L NaCl-TBS洗脫蛋白樣品進一步通過Sephadex G-100凝膠層析，得到一個無拖尾的對稱峰B，并通過Tricine-SDS-PAGE 凝膠分析和Western Blot免疫印跡分析，證實洗脫峰B為致敏蛋白成分，其分子量在35～48 kD。該方法操作簡單，節省時間，能更好保持蛋白的性質，可用于目標蛋白的純化和富集。組胺是脫顆粒反應最典型的標志物，但它極不穩定（半衰期為30～60 min），溫度和孵育時間變化均可影響含量測定，而β-氨基己糖苷酶穩定性好，釋放率與肥大細胞脫顆粒程度一致，與組胺釋放率成正相關，作為肥大細胞脫顆粒標志物重復性更好[14-15]。因此，通常測定β-氨基己糖苷酶釋放率來反映細胞脫顆粒作用。實驗結果表明洗脫峰B蛋白能引起β-氨基己糖苷酶釋放率顯著升高，驗證了洗脫峰B蛋白的致敏性。綜上所述，紅花注射液中潛在致敏蛋白成分為洗脫峰B中的蛋白成分，其分子量在35～48 kD。這一研究結果將為紅花注射液制劑生產中去除或降低致敏原提供理論依據，從而降低紅花注射液臨床應用過敏反應發生風險，提高其臨床應用安全性。