新一代腫瘤標(biāo)志物循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型在宮頸癌診斷中的臨床意義

張俊華，袁高亮，紀(jì)麗偉

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 蘇州 215000)

宮頸癌(cervical cancer，CC)是女性常見的惡性腫瘤之一[1]。近年來，CC的發(fā)病率逐年上升，且呈年輕化趨勢[2-3]。CC的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是造成死亡的重要原因之一。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞從原發(fā)灶分離后到達(dá)血液，成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC)，可靶向遠(yuǎn)處器官并有助于繼發(fā)性腫瘤的發(fā)生[4]。與計算機(jī)斷層和正電子發(fā)射斷層掃描相比，CTC檢測有助于更早、更有效地診斷腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[5]。循環(huán)腫瘤微栓(circulating tumor microemboli,CTM)即兩個或以上CTC集群，有利于細(xì)胞之間的生物信息傳遞，更容易在血流剪切壓力下存活[6]，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于CTC/CTM在CC癌患者中臨床意義的研究甚少，本文旨在探究CTC/CTM在CC癌患者中的分布及與臨床特征和血清腫瘤標(biāo)志物表達(dá)水平之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2016年4月—2020年4月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬蘇州九龍醫(yī)院收治的擬進(jìn)行手術(shù)的初治患者32例，術(shù)后病理診斷為宮頸癌。納入標(biāo)準(zhǔn)：未經(jīng)過放療、化療和激素治療。排除第二原發(fā)腫瘤患者、妊娠和哺乳期患者、合并自身免疫疾病患者、嚴(yán)重肝腎不全患者。年齡28～65歲，平均(48.41±5.51)歲；鱗癌25例，腺癌6例，其他1例；術(shù)后腫瘤病理分期及分級分別參照WHO分級標(biāo)準(zhǔn)和國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟推薦標(biāo)準(zhǔn)[7-8]：Ⅰ期6例、Ⅱ期11例、Ⅲ期6例、Ⅳ期9例。

本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)通過，所有受試者均自愿簽訂知情同意書。

1.2方法

1.2.1病理資料 收集32例患者的年齡、病理類型、臨床分期和病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。同時記錄采血時1周內(nèi)血清CA125、CA199和SCC-Ag的表達(dá)水平。

1.2.2CTC和CTM檢測方法 CTC檢測試劑盒購于江蘇萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司，其試劑盒具體包括人外周血白細(xì)胞去除試劑盒(抗人CD45熒光免疫抗體染色試劑，抗人EpCAM的熒光免疫抗體染色試劑)和8號染色體著絲粒熒光原位雜交樣品處理試劑盒。

采集肘靜脈血4 mL于ACD抗凝的黃色采血管中，避光低溫保存，24 h內(nèi)檢測。應(yīng)用紅細(xì)胞裂解法除去紅細(xì)胞，磁珠抗體除去白細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)染色腫瘤標(biāo)志物，再利用熒光原位雜交技術(shù)標(biāo)記8號染色體。上述實(shí)驗操作完成后在熒光顯微鏡下觀察。先將顯微物鏡鏡頭調(diào)至×10，然后按照讀片規(guī)則依次讀片，在不同視野過程中發(fā)現(xiàn)CD45陰性細(xì)胞，確定8號染色體的數(shù)目后，再依次自動調(diào)至藍(lán)光、綠光下鏡下觀察。CTC的判讀標(biāo)準(zhǔn)為EpCAM+/CD45-/DAPI+/CEP8≥2或者EpCAM-/CD45-/DAPI+/CEP8≥2；CTM的判讀標(biāo)準(zhǔn)為單個循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量≥2個CTC聚集成的細(xì)胞團(tuán)。

1.2.3血清標(biāo)志物CA125、CA199和SCC-Ag檢測方法 采集空腹肘靜脈血3 mL，靜置離心后分上層血清，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)檢測CA125、CA199和SCC-Ag的表達(dá)水平(羅氏Cobas e601型全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)及配套試劑)。血清標(biāo)志物檢測的判定結(jié)果參考配套試劑的說明書，CA125≥35 kU/L為陽性，CA199≥35 kU/L為陽性，SCC-Ag≥1.5 μg/L為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌患者外周血中CTC/CTM各亞型的分布情況 收集32例宮頸癌患者的外周血，熒光顯微鏡下觀察CTC/CTM(圖1)。32例檢出CTC陽性29例，陽性檢出率為90.63%；檢出CTM陽性9例，陽性檢出率為28.13%。

29例CTC陽性宮頸癌患者中檢出三倍體CTC 19例，三倍體陽性檢出率為59.40%，檢出范圍為0～7個/4 mL，檢出個數(shù)為(1.50±1.90)個；檢出四倍體CTC 16例，四倍體陽性檢出率為55.10%，檢出范圍為0～5個/4 mL，檢出個數(shù)為(0.97±1.31)個；檢出多倍體CTC 22例，多倍體陽性檢出率為68.80%，檢出范圍為0～7個/4 mL，檢出個數(shù)為(1.78±1.93)個。

圖1 宮頸癌患者外周血中的CTC/CTM(×100)A.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號染色體為三體的CTC;B.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號染色體為四體的CTC;C.EpCAM-/CD45-/DAPI+/8號染色體≥五倍體的CTC;D.EpCAM+/CD45-/DAPI+/8號染色體≥五倍體的CTC;E.EpCAM+的CTM;F.EpCAM-的CTMFigure1 CTC/CTMinperipheralbloodofcervicalcancerpatients(×100)

2.2宮頸癌患者外周血中CTC/CTM計數(shù)基線與臨床不良病理特征的關(guān)系 不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況宮頸癌患者CTC陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，不同年齡、病理類型和臨床分期宮頸癌患者CTC陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。不同臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況宮頸癌患者CTM陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，不同年齡、病理類型宮頸癌患者CTM陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。各個分期的初治宮頸癌患者和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者的外周血中均可以檢測出CTC，Ⅲ期和Ⅳ期患者 CTC陽性檢出率略高于Ⅰ期和Ⅱ期患者。

表1 不同病理特征宮頸癌患者外周血中CTC、CTM陽性率比較

2.3宮頸癌患者外周血中血清標(biāo)志物CA125、CA199和SCC-Ag的表達(dá)水平分布 分析初治32例宮頸癌患者檢測時間點(diǎn)1周內(nèi)的血清腫瘤標(biāo)志物，檢出CA125陽性28例，陽性檢出率為87.5%，檢出水平范圍為25.9～537.7 kU/L，平均(149.9±131.6)kU/L；檢出CA199陽性28例，陽性檢出率為87.5%，檢出水平范圍為16.4～190.4 kU/L，平均(70.9±37.1)kU/L；檢出SCC-Ag陽性24例，陽性檢出率為75.0%，檢出水平范圍為0.3～10.2 μg/L，平均(4.2±3.0)μg/L。

2.4宮頸癌患者CTC、CTM與血清標(biāo)志物的相關(guān)性分析 CTC、CTM與CA125、CA199和SCC-Ag均無相關(guān)性(P>0.05)。見表2。

表2 宮頸癌患者CTC、CTM與血清標(biāo)志物的相關(guān)性分析

3 討 論

CC發(fā)生在子宮頸的上皮，特別是在子宮頸和子宮頸的鱗狀小柱交界處，這是一個連續(xù)的代謝活動部位[9]。近年來，CC的診斷和治療取得了重大進(jìn)展，但總體5年生存率仍然很低[9]。目前，宮頸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的診斷主要依賴于醫(yī)學(xué)影像，血清腫瘤標(biāo)志物,病理組織等手段。CTC/CTM作為一種新興的腫瘤分子標(biāo)記物，有助于腫瘤的個體化治療，為臨床早期診斷、療效和預(yù)后評估提供指導(dǎo)。外周血中CTC/CTM檢測被認(rèn)為是實(shí)體瘤的“液體活組織檢查”，因為其容易形成，發(fā)生率高，創(chuàng)傷小[10]。本研究結(jié)果表明，CTC陽性檢出率為90.63%，在其他研究報道的CTC檢測率66.6%～98.1%范圍內(nèi)[11-12]；CTM陽性檢出率為28.13%。此外，在29例CTC陽性的宮頸癌患者中，三倍體CTC陽性檢出率為59.4%；四倍體CTC陽性檢出率為55.1%；多倍體CTC陽性檢出率為68.8%。本研究結(jié)果顯示，CC患者外周血CTC陽性率較高，提示術(shù)前檢測CTC可作為一種新的指標(biāo)，實(shí)時反映CC患者的微轉(zhuǎn)移狀態(tài)和復(fù)發(fā)風(fēng)險，反過來又可以在真正復(fù)發(fā)之前提供治療時間。

越來越多的證據(jù)證明，CTC/CTM是診斷、預(yù)后和藥理學(xué)目的的臨床標(biāo)志物。因此，CTC/CTM的檢測和表征已成為世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)。CTC/CTM在轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中的預(yù)后意義已被廣泛報道。此外，外周血CTC/CTM作為一種非侵入性指標(biāo)，將使臨床醫(yī)生能夠為宮頸癌患者設(shè)計個體化的術(shù)后輔助治療，以減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，提高腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量[13-15]。CTC作為癌癥的預(yù)后標(biāo)志物具有良好的應(yīng)用前景。早期乳腺癌患者每30 mL血液中CTC≥5的預(yù)后較差[16]。非轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者外周血CTC≥1/7.5 mL時，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險大，預(yù)后差[17]。在各種癌癥中，CTC計數(shù)與患者年齡、疾病階段、組織學(xué)分化、腫瘤大小和病理類型之間的相關(guān)性是不同的。本研究觀察了CTC/CTM陽性率與臨床病理特征之間的關(guān)系。CTC陽性檢出率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與年齡、病理類型和臨床分期均無相關(guān)。CTM陽性檢出率與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與年齡、病理類型無相關(guān)。此外，各個分期的初治CC患者和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CC患者外周血中均可以檢測出CTC，Ⅲ期和Ⅳ期患者CTC陽性檢出率略高于Ⅰ期和Ⅱ期患者。這些結(jié)果表明，外周血中CTC/CTM含量較高的早期CC患者也有較高的風(fēng)險出現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[18]，與CC的惡性程度密切相關(guān)，是不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素之一。

腫瘤標(biāo)志物檢測為早期惡性腫瘤的術(shù)前預(yù)測提供了一種新的解決方案，已從惡性腫瘤患者的血清中檢測到一些與腫瘤相關(guān)的抗原，且與疾病的臨床分期等病理特征有關(guān)[19]。與婦科癌癥密切相關(guān)的惡性腫瘤血清標(biāo)志物(包括SCC-Ag、AFP、CA153、CEA、CA125和CA199)對評估治療前、評估療效和患者預(yù)后具有重要價值[20]。SCC-Ag和CA125是目前CC檢測的常用標(biāo)記物[21]。王若琪等[22]研究發(fā)現(xiàn)，CA199在CC患者血清中的陽性率升高。本研究收集了CC患者的臨床病理數(shù)據(jù)，并分析了其與術(shù)前血清腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系，以尋找可預(yù)測的危險因素。CA125、CA199、SCC-Ag陽性檢出率分別為87.5%、87.5%和75.0%。此外，將CTC/CTM與CA125、CA199和SCC-Ag進(jìn)行相關(guān)分析，未發(fā)現(xiàn)CTC/CTM基線計數(shù)與3種標(biāo)記物具有明顯相關(guān)性。

本研究納入的目標(biāo)樣本數(shù)量偏少，后續(xù)研究將擴(kuò)大樣本量作進(jìn)一步的驗證分析，CTC/CTM與腫瘤標(biāo)志物的臨床價值還需要通過大規(guī)模多中心研究來深入探究其具體作用機(jī)制。

綜上所述，同時檢測CTC/CTM和和血清腫瘤標(biāo)志物有助于CC微轉(zhuǎn)移的早期診斷和疾病狀態(tài)的評估，具有很高的臨床應(yīng)用價值。隨著CTC/CTM研究的不斷深入，可作為CC精準(zhǔn)治療的臨床指標(biāo)。