烏司他丁治療百草枯中毒患者的臨床療效及對炎性細胞因子、T淋巴細胞亞群的影響

劉家燕，王 鑫，李康然，孔祥玉，秦 莉，曹志嬌

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院急診科，河北 邯鄲 056001)

百草枯是高效、季胺類除草劑。我國是一個農業(yè)大國，百草枯在我國廣泛應用，因此中毒患者數量也呈逐年上升趨勢。百草枯進入體內，造成多器官功能衰竭，病情危重，主要損傷肺、肝、腎等重要臟器，患者病死率高，而且無特效解毒藥物[1]。目前百草枯中毒的病理過程還不十分清楚，雖然前期研究取得一些進展，但其分子機制尚未闡明。已有研究表明，百草枯中毒所導致的臟器損傷與激活的炎性細胞因子白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)以及T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+免疫調節(jié)紊亂緊密相關[2]。烏司他丁是從尿中提取的一種糖蛋白，在新近的研究中發(fā)現(xiàn)，它具有抑制蛋白酶的活性、抗氧化、阻止炎性細胞因子的釋放等作用[3]。本研究選取邯鄲市中心醫(yī)院急診科收治的急性口服百草枯中毒患者80例作為研究對象，探討烏司他丁治療百草枯患者的臨床療效以及對炎性細胞因子和T淋巴細胞亞群的影響，為臨床提高救治率、降低病死率提供理論參考。現(xiàn)將研究成果報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月—2019年12月邯鄲市中心醫(yī)院收治的百草枯中毒患者80例，均符合《急性百草枯中毒診治專家共識(2013)》診斷標準[4]，所有患者年齡大于18歲，都是口服中毒，服毒量為5～100 mL,患者的血和尿中均檢測出百草枯成分，從服毒到來醫(yī)院就診時間小于6 h。排除標準：既往有嚴重的基礎疾病，如心、腦血管系統(tǒng)疾病、肝、腎功能障礙，嚴重貧血，惡性腫瘤，生活不能自理者。患者簽屬知情同意書，自愿參加該實驗。將納入研究的患者按照就診先后順序分為對照組40例、治療組40例進行臨床指標比較，在兩組中能夠存活14 d的患者(對照組21例，治療組30例)再進行血液生化、炎性細胞因子、T巴細胞亞群的比較。對照組：男性14例，女性26例，年齡20～69歲，平均(46.50±5.53)歲；治療組：男性16例，女性24例，年齡25～63歲，平均(44.46±5.61)歲。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

本研究獲得邯鄲市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2治療方法 2組患者就診后均給予基礎治療。①阻止毒物吸收：立即給予清水洗胃，大約需要5 L以上，直至洗胃液清亮。之后20%甘露醇250 mL、硫酸鎂粉40 g口服導瀉，活性炭100 g分次口服；②血液凈化治療：12 h/次，共進行6次。每次治療包括2 h血液灌流(HA-330灌流器由健帆生物科技公司提供)和4 h血液透析；③抑制炎癥反應：激素甲潑尼龍10～15 mg·kg-1·d-1聯(lián)合免疫抑制劑環(huán)磷酰胺5～10 mg·kg-1·d-1沖擊，依據病情逐漸減量。④積極抗氧化治療：口服褪黑素、維生素E，靜脈應用谷胱甘肽、大量維生素C、氨溴索、丹參等⑤其他輔助治療：普萘洛爾、當歸、川芎、連翹等。口腔及食道有灼傷的患者口服康復新液、金因肽，對于頻繁嘔吐的給予胃復安、質子泵抑制劑等治療，重癥中毒患者，往往有合并癥存在，還應積極預防感染。

治療組在上述治療的基礎上，加用烏司他丁(又名：天普洛安，廣東天普生化醫(yī)藥有限公司生產，批準文號:國藥準字H20045327，規(guī)格：10萬U/支)治療，30萬U/次，2次/d靜脈滴注，療程14 d。

1.3觀察指標

1.3.1臨床指標 觀察14 d 2組患者急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的發(fā)生率(%)、ICU住院時間(d)、存活率(%)、死亡患者存活時間(d)。

1.3.2血液生化及炎性因子指標 2組患者在治療前、治療7 d、治療14 d從肘靜脈抽取血液10 mL，在4 ℃條件下高速(4 000 r/min)離心20 min，提取上清液，保存于日本三洋株式會社生產的超低溫冰箱(-80 ℃)待檢。采用日本東芝TOSHIBA-40FR全自動生化分析儀檢測肝腎功能指標丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)，天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)，肌酐(creatinine，Cr)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血液中IL-8、TNF-α、MMP-9的含量，試劑盒由武漢博士德公司提供，操作步驟(包被、洗滌、封閉、加入一抗、二抗、顯色)嚴格按照說明書進行，采用西班牙Cri-Tzw kEnzyme熒光酶標儀測量450 nm光波處標本的OD值。根據吸光度值的標準曲線，計算IL-8、TNF-α、MMP-9的含量。

1.3.3T淋巴細胞亞群檢測 采用SAP酶標法檢測2組患者治療前、治療7 d、治療14 d的血液中T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+百分比。在血液標本中加入一抗工作液，在室溫孵育20 min,用PBS液進行反復沖洗,加入生物素標記的二抗S-A/AP試劑盒(由美國ZYMED公司生產)，然后加入堿磷酶標記的鏈霉卵白素形成復合物，最后滴入顯色劑，借助堿磷酶使底物顯色。使用默賽飛EVOS M7000顯微成像系統(tǒng)觀察帶有紅色標記的陽性細胞，計算出陽性細胞百分比。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數據。計數資料采用χ2檢驗；計量資料采用獨立樣本t檢驗和重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.12組患者臨床指標比較 治療組患者ALI/ARDS的發(fā)生率、ICU的住院時間顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組的存活例數和死亡患者存活時間顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組臨床指標比較

2.22組患者血液生化指標比較 在治療后，2組患者ALT、AST、BUN、Cr均有不同程度的下降，2組在組間、時點間、組間·時點間交互作差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 2組血液生化指標比較

2.3TNF-α、MMP-9含量的變化 經烏司他丁治療后，2組患者中IL-8、TNF-α、MMP-9的含量均降低，2組在組間、時點間、組間·時點間交互作差異均有統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 2組患者炎性細胞因子含量比較

2.4兩組患者血液中T淋巴細胞亞群比較 治療后，外周血T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+含量較治療前升高(P<0.05)，CD8+含量反而下降(P<0.05)；與對照組比較，治療組在應用烏司他丁治療后，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+升高更加顯著(P<0.05)，CD8+含量下降更為明顯(P<0.05)。2組在組間、時點間、組間·時點間交互作差異均有統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 兩組患者血液中T淋巴細胞亞群水平比較

3 討 論

近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)臟器損傷與炎癥反應導致的免疫紊亂息息相關，因此，在探討百草枯中毒病理過程中,炎癥反應及其免疫紊亂成為人們研究的熱點問題。百草枯可以經皮膚、呼吸道、口服等多種途徑導致中毒，但口服是主要途徑。基礎研究和動物實驗均表明，進入體內的百草枯作為電子載體，與氧結合生成有活性的超氧陰離子，在過氧化物歧化酶的作用下進一步生成H2O2，H2O2經過氧化還原反應生成高活性的氧自由基，從而誘導機體產生級聯(lián)放大的炎癥反應并釋放大量炎性細胞因子，導致免疫功能紊亂，引起細胞損傷、凋亡，破壞臟器功能[5]。烏司他丁是從尿液中提取的一種蛋白酶抑制劑，相對分子質量6 700 000，143個氨基酸組成，它對纖溶酶、α-糜蛋白酶、絲氨酸酶、胰蛋白酶等多種酶有抑制作用，同時還可以穩(wěn)定溶酶體膜，阻止溶酶體酶的活化，減少炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞等的聚集，清除氧自由基、抑制炎性介質的釋放，調節(jié)免疫功能[6]。我國雖然已經對百草枯中毒進行了深入的研究，但烏司他丁對其的治療暫無確切的臨床結論。本研究將烏司他丁注射液用于百草枯的治療，明顯降低了中毒患者ALL/ARDS的發(fā)生率，提高了存活率，縮短了在ICU內的住院時間，延長了死亡患者的存活時間，血液生化指標ALT、AST、Cr、BUN也明顯下降，改善了中毒患者的臨床及生化指標。

研究表明，炎癥反應及其產生的細胞因子在百草枯中毒病理過程中起著極其重要的作用[7]。炎性細胞因子IL-8是由上皮細胞和巨噬細胞產生的[8]。在炎癥反應中具有很強的趨化作用，它可以趨化并激活中性粒細胞、T淋巴細胞等炎性細胞，這些被激活的炎性細胞進一步合成和釋放TNF-α、MMP-9等多種炎性細胞因子，參與炎癥反應，導致組織細胞功能和結構的損傷[9]。TNF-α作為炎癥反應的早期細胞因子，促使各種免疫應答和炎性反應，它主要由活化的巨噬細胞、單核細胞、B淋巴細胞及T淋巴細胞產生[10]。具有啟動、調節(jié)炎癥反應的作用。目前研究證明，在血管表皮細胞、中性粒細胞、內皮細胞、腹腔間皮細胞等多種細胞表面存在TNF-α受體，當TNF-α與受體結合后，促使細胞產生和分泌MMP-9、IL-1、IL-6、IL-8等細胞因子，起到放大炎癥反應的效應。基質金屬蛋白酶MMP-9是一種糖蛋白，又稱為明膠酶B，它是由單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等細胞分泌的，以膠原蛋白、彈性蛋白、Ⅳ型膠原為底物，降解細胞外基質成分，破壞組織結構[11]。IL-8、TNF-α、MMP-9在炎癥反應中相互協(xié)同、相互輔助，形成正反饋效應。實驗證明，MMP-9基因序列的啟動子存在TNF-α的結合位點，TNF-α與之結合，促進MMP-9的基因表達，當該結合位點被阻斷后，TNF-α上調MMP-9的作用也被抑制[12]。MMP-9不僅接受TNF-α、IL-8的調節(jié)，還可以協(xié)助相關轉化酶，使TNF-α的前體轉化為有活性的TNF-α。另外，MMP-9還通過裂解IL-8氨基末端特異位點，使IL-8趨化活性較原來增加30倍。已有研究表明，許多疾病的病理學改變如膿毒癥、多臟器功能衰竭、急性呼吸窘迫綜合征與炎性細胞因子IL-8、TNF-α、MMP-9水平增高密切相關[13]。本研究結果顯示，在百草枯中毒治療前的各個時間點，血漿中炎性細胞因子IL-8、TNF-α、MMP-9含量均呈高水平表達，提示在百草枯中毒中，IL-8、TNF-α、MMP-9起重要作用，經過烏司他丁治療后，IL-8、TNF-α、MMP-9均有不同程度的下降，與治療前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明烏司他丁能夠抑制百草枯中毒導致的炎癥反應，減少炎性細胞因子的產生，對百草枯中毒的救治有積極的作用。

近期研究發(fā)展，多種疾病的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫功能紊亂密切相關[14]。T淋巴細胞亞群是反映機體免疫功能狀態(tài)和平衡情況的重要指標。在眾多實驗中發(fā)現(xiàn)，通過對T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的分析，可以判斷疾病嚴重程度[15]。CD3+是免疫系統(tǒng)中最為重要的組成部份，它既參與細胞免疫，又調控體液免疫。CD4+屬于輔助/誘導性T淋巴細胞，通過調節(jié)TNF-β、IL-2、IFN-γ細胞因子和IL-4、5、6、10的分泌輔助B淋巴細胞產生抗體，從而調控體液免疫。CD8+屬于抑制/細胞毒性T淋巴細胞，能夠識別靶細胞，誘導靶細胞溶解凋亡。正常狀態(tài)下，T淋巴細胞每個亞群的數量處于動態(tài)平衡，它們之間既互相協(xié)作又相互制約，維持機體免疫功能的穩(wěn)定[16]。當機體出現(xiàn)病理改變時，T淋巴細胞總數CD3+、CD4+、CD8+以及它們的比值發(fā)生變化，免疫功能受損，調節(jié)發(fā)生紊亂。因此，觀察T淋巴細胞亞群數目的變化，成為研究百草枯中毒患者免疫功能的簡便可靠方法。本研究結果顯示，在百草枯中毒后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均降低，CD8+含量增高，提示T淋巴細胞功能處于紊亂狀態(tài)，機體免疫受到抑制。在應用烏司他丁治療后，治療組患者的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均升高，CD8+含量降低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明烏司他丁可以糾正百草枯中毒患者T淋巴細胞亞群失調的狀態(tài)，改善組織細胞免疫功能紊亂，調節(jié)免疫細胞活性，提高機體免疫力。因此，烏司他丁對機體T淋巴細胞的免疫調節(jié)作用可以為百草枯中毒治療提供新的思路。

綜上所述，通過研究烏司他丁對百草枯中毒患者炎性細胞因子及T淋巴細胞亞群的影響，不僅闡明了百草枯中毒的病理機制，而且也為烏司他丁治療百草枯中毒奠定了理論基礎。實驗表明，烏司他丁抑制了炎性因子的釋放，調節(jié)了機體的免疫功能，改善了中毒患者內環(huán)境的平衡狀態(tài)，對百草枯中毒的治療發(fā)揮了積極的作用，值得推廣。