鮮蒜貯藏期主要病原菌分離鑒定及臭氧抑菌效果研究

蘭 璞，紀海鵬，賈 凝，張 娜，于晉澤，董成虎,3,*

（1.天津市農業科學院，天津 300384；2.天津市農業科學院農產品保鮮與加工技術研究所（國家農產品保鮮工

程技術研究中心（天津）），農業農村部農產品貯藏保鮮重點實驗室，天津市農產品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384；3.天津市興有果蔬種植專業合作社，天津 301714）

大蒜（AlliumsativumL.）也稱為蒜頭、大蒜頭、胡蒜，是蒜類植物的統稱[1]，為半年生草本植物，屬百合科蔥屬，以鱗莖入藥。從古至今埃及、中國、日本等一直用大蒜治療多種疾病。大蒜是秦漢時從西域傳入我國，經人工栽培繁育，具有抗癌功效，深受大眾喜食[2]。大蒜呈扁球形或短圓錐形，外層是灰白色或淡棕色膜質鱗皮，剝去鱗葉，內有6～10個蒜瓣，輪生于花莖的周圍，莖基部盤狀，生有多數須根，有濃烈的蒜臭，味辛辣，有刺激性氣味，可食用或供調味。目前我國大蒜主要栽培品種有：山東蒼山大蒜品種群、吉林白馬芽、山東金鄉白蒜、江蘇太倉白蒜、陜西蔡家坡紫皮蒜、黑龍江阿城大蒜、天津寶坻大蒜等。本研究所選試材為天津寶坻大蒜，以6瓣為主，蒜瓣在莖盤上圍成一輪，蒜皮為紫紅色，蒜瓣潔白、均勻，鮮嫩多汁，口感辛辣，脆香濃郁，肉質肥厚[3]。大蒜傳統的貯藏方法有掛藏法、堆藏法、埋藏法、輻射貯藏和化學藥劑處理貯藏[4]。目前市場上流通的大蒜主要是干蒜，源于其耐貯性。事實上新鮮大蒜口感更為鮮美，適于鮮食，但不易保存，在貯運過程中易受微生物污染，導致蒜瓣失水干縮、腐敗發芽、易霉化軟爛等問題發生，使鮮蒜的品質和商品價值受到影響。

目前果蔬的貯藏保鮮方法主要有低溫、臭氧、1-甲基環丙烯（1-Methylcyclopropene，1-MCP）、涂膜、煙霧劑保鮮等。曹琳等[5]研究表明：臭氧處理大蒜可有效抑制赤霉、橘青霉等的生長發育，改變菌體形態。張靜林等[6]采用30 mg/m3臭氧對脫水蒜片進行處理，發現蒜片中菌落總數得到顯著抑制，且不影響蒜片內的營養成分。姜楠等[7]發現采用臭氧處理后的交鏈孢菌對生物活性的不良影響顯著降低，同時發現適宜濃度的臭氧處理能夠降解交鏈孢菌的多種芽孢菌，使得毒力得以顯著降低。臭氧由于具有強氧化性且使用后無殘留，被廣泛應用于食品加工車間食品表面殺菌、防腐保鮮等多個領域[8]。臭氧處理果蔬，既有可靠的殺菌保鮮效果，又沒有任何有害殘留[9-10]。冷藏或氣調貯藏配合臭氧處理是一項新型的果蔬保鮮方式[11]。根據臭氧在果蔬貯藏的研究報道，明確得到的結論是隨貯藏庫溫度升高或相對濕度增加，臭氧的分解速率明顯加快[12]。每年的冬季市面上大多為干蒜，鮮有可口的鮮蒜，因此本研究主要以貯藏5個月的寶坻鮮蒜為試材，進一步探索驗證貯藏后期鮮蒜的主要致病微生物和致病微生物控制方法，以期獲得新鮮的大蒜病害控制技術，滿足廣大消費者對鮮蒜食用需求。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

材料：貯藏后期的寶坻鮮蒜，于2019年5月購買，鮮蒜購買時含水量為64～66 g/100 g。挑選整理后用長1 m、寬0.6 m、厚度0.05 mm的鮮蒜專用PE袋包裝，每袋15 kg置于冷庫的架子上，貯藏溫度（0±0.5）℃，相對濕度（RH）90%～95%，至2019年12月之后開始出現輕微發霉現象，挑選表面已霉變或產生霉變趨勢，甚至生長出病原菌的鮮蒜進行致病微生物的分離鑒定，對分離的菌株進行鮮蒜反接種及分離純化，并采用臭氧處理進行鮮蒜主要致病菌的抑制試驗。

瓊脂粉，北京奧博星生物化學試劑科技有限公司產品；葡萄糖，天津市科威有限公司產品；土豆，購于天津市西青區物美超市。

1.1.2 儀器與設備

VS-1300-V型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SPX-250B智能生化培養箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；氣調冷庫，意大利Isolcell公司；557115游標卡尺，艾威博爾研發制造有限公司；BX51TF攝像顯微鏡，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制

采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）培養大蒜的病害組織，即去皮馬鈴薯200 g，瓊脂15～20 g，葡萄糖20 g，超純水1 000 mL。

1.2.2 大蒜病原真菌的分離流程

冷藏條件下獲取發病大蒜→無菌環境下分離大蒜病害組織→PDA培養基培養病害組織→鏡檢→培養基上多次純化→獲得單菌落菌株→鏡檢→確定病原菌[13-14]

1.2.3 大蒜病原真菌菌落形態觀察及分離鑒定

觀察分離培養基平板上菌落的形態，包括形狀、色澤、大小、菌絲特征[15-16]；將單菌落的病原菌制片后無需染色直接在4倍、10倍、20倍和40倍目鏡下觀察菌絲形態和孢子形狀，記錄觀察結果并拍照[17]；分離純化后的菌種經過反接種試驗來確定其致病性，如果發病癥狀與貯藏中的腐爛癥狀相同[18-19]，作為采后病害病原菌進一步鑒定到屬種，分離鑒定方法參照《真菌鑒定手冊》等書籍[20-23]。

1.2.4 主要病原菌回接與臭氧處理

在無菌環境下切分發病鮮蒜病斑與健康組織交界處（1 cm×1 cm）后置于PDA培養基上，隨后放入培養箱中，設定培養箱環境為25℃。在已培養好的平板上打孔取菌餅，將菌餅置于新培養基中央繼續培養，重復3次后得到純化病原菌，采用菌液法[22]制備孢子懸浮液。

將主要病原菌侵染回接至已消毒的健康鮮蒜上，采用刺傷接種法[14]，使用無菌針在鮮蒜赤道部位制造傷口（大小約為4 mm×4 mm），將10μL孢子液注入傷口，被接種的鮮蒜貯藏在不同溫度（0、25℃）條件下通過不同濃度（17.152、21.44 mg/m3）的臭氧氣體熏蒸處理，每天進行不同時間（12、18 h）臭氧處理，共貯藏7 d。

每天隨機取樣，采用“十字交叉法”測量鮮蒜表面菌落的直徑，每次取各處理組10個鮮蒜進行測定，每次測定重復3次。選擇25℃旨在模擬室溫貨架溫度，同時將不同溫度下不作其他處理的接種大蒜作為空白對照組（CK）[24-25]。

1.2.5 數據處理

使用Excel 2016軟件處理數據與作圖，使用SPSS 20.0軟件用Duncan檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 鮮蒜病原菌菌落細胞形態特征觀察及鑒定

在本試驗的冷藏條件下貯藏半年后，鮮蒜表面出現病斑。分離出鮮蒜的病變組織，并用PDA培養基培養。在顯微鏡下觀察后，通過劃線法分離，經過多次純化后，得出單菌落菌株，分別鏡檢，確定鮮蒜的病原菌。

如圖1A所示，分生孢子呈紡錘狀或倒棒狀，頂端延長成喙狀，多細胞，有壁磚狀分隔，分生孢子常數個成鏈。根據菌落細胞的形態特征，確定為交鏈孢綱中的交鏈孢屬（Alternaria），容易引起新鮮大蒜發生黑斑病[26-27]。

圖1 3種致病真菌形態特征Fig.1 Morphological characteristics of three pathogenic fungi

如圖1B所示，菌絲頂端分枝形如掃帚，有橫隔，其分生孢子梗經多次分枝，產生幾輪對稱或不對稱的小梗，分生孢子呈球形、橢圓形或短柱形，光滑或粗糙。根據菌落細胞的形態特征，確定為半知菌亞門絲孢中的產黃青霉（Penicilliumchrysogenum），易引起大蒜發生黃青霉病[13]。

如圖1C所示，分生孢子梗直立、透明、光滑，分生孢子透明、光滑，多數長圓形，亦有擬橢圓形、卵圓形或不規則長圓形孢子，或多或少呈平行的，或不同角度的傾斜排列。根據菌落細胞形態特征，確定為青霉屬中的斜鏈擬青霉（PaecilomycescateniobliquusLiang），易引起大蒜黑霉病[13,25]。

通過鮮蒜致病微生物分離鑒定出的致病菌，結合貯藏后期鮮蒜發病情況統計得出其發病指數，發現冷庫貯藏鮮蒜中交鏈孢霉的發病率最高，為69.3%，而觀測發現致病菌產黃青霉、斜鏈擬青霉在低溫冷藏條件下的發病率較低，分別為24.7%和17.9%，即控制交鏈孢霉的生長能夠影響庫內大部分鮮蒜霉變，且臭氧抑制交鏈孢屬效果已有研究表明有效[5]。為此本研究以分離純化的交鏈孢霉在不同臭氧處理條件下的生長情況作比較分析，通過測量菌落在臭氧處理后的環境中生長大小的直徑判定臭氧對其控制作用。

2.2 臭氧抑制鮮蒜貯藏期交鏈孢霉的研究

2.2.1 0℃下不同濃度臭氧處理12 h對鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長的影響

由圖2可見，在0℃下，隨著貯藏時間的延長，鮮蒜表面的菌落直徑呈增大的變化趨勢。整個貯藏期內，空白對照組菌落直徑始終顯著高于臭氧處理組（P＜0.05）。可見與同溫度下未經處理的空白對照組相比，臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3下處理12 h的交鏈孢霉生長速度得到了明顯的抑制，且21.44 mg/m3臭氧處理組比17.152 mg/m3臭氧處理組的菌落直徑更小。所以在相同溫度（0℃）和處理時間（12 h）下，臭氧處理的濃度越大，菌落生長更為緩慢，抑菌效果更好，且證實了0℃下臭氧處理對交鏈孢霉的生長具有明顯的抑制作用。

圖2 0℃下不同濃度臭氧處理12 h對鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.2 Effects of ozone treatments with different concentrations at 0℃for 12 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.2 0℃下不同濃度臭氧處理18 h對鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長的影響

如圖3所示，在0℃下，空白對照組和臭氧處理組鮮蒜表面菌落直徑在整個貯藏過程中均呈上升趨勢。其中，對照組在整個貯藏過程中菌落直徑顯著高于臭氧處理組（P＜0.05），可見與同溫度下未經處理的空白對照組比較，在臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3下處理18 h的菌落生長速度得到了明顯的抑制。且在相同溫度（0℃）和處理時間（18 h）下，21.44 mg/m3比17.152 mg/m3臭氧濃度處理菌落生長更為緩慢，抑菌效果更好。證實了在0℃下臭氧處理對交鏈孢霉的生長有明顯的抑制作用。

圖3 0℃下不同濃度臭氧處理18 h對鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.3 Effects of ozone treatments with different concentrations at 0℃for 18 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.3 25℃下不同濃度臭氧處理12 h對鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長的影響

由圖4可以看出，自接種第3天后，17.152 mg/m3組的菌落直徑與空白對照組出現差異，而21.44 mg/m3組于接種第2天后差異逐漸明顯。與同溫度下未經處理的空白對照組相比，臭氧濃度為17.152 mg/m3和21.44 mg/m3處理12 h下交鏈孢霉的生長速度得到了明顯的抑制。25℃貯藏溫度下，接種5 d后菌落迅速布滿果實表面，同時菌落創面軟化塌陷嚴重，已無法繼續觀測，故不再進行量取。貯藏3 d后在相同溫度（25℃）和處理時間（12 h）下，17.152 mg/m3臭氧處理組比21.44 mg/m3組菌落直徑小，可見17.152 mg/m3臭氧處理組比21.44 mg/m3處理組抑菌效果更為有效。

圖4 25℃下不同濃度臭氧處理12 h對鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.4 Effects of ozone treatments with different concentrations at 25℃for 12 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

2.2.4 25℃下不同濃度臭氧處理18 h對鮮蒜貯藏期交鏈孢霉生長的影響

由圖5可以看出，在25℃下，臭氧濃度為21.44 mg/m3處理18 h與同溫度下未經處理的空白對照組菌落生長情況基本一致，并未出現較明顯的抑制作用。同時，21.44 mg/m3臭氧處理組菌落直徑與對照組之間差異較小。而17.152 mg/m3臭氧處理組貯藏第2、4、5天的菌落直徑顯著低于其他兩組（P＜0.05）。證實臭氧熏蒸處理能抑制鮮蒜表面病斑直徑的擴大，最終觀測菌落直徑發現無論是在0℃下還是25℃下，17.152 mg/m3臭氧都對交鏈孢霉產生了抑制作用，而且這種抑制在0℃下更為明顯。

圖5 25℃下不同濃度臭氧處理18 h對鮮蒜接種交鏈孢霉菌落直徑的影響Fig.5 Effects of ozone treatments with different concentrations at 25℃for 18 h on the colony diameters of Alternaria inoculated in fresh garlic

3 結論與討論

由于臭氧只作用在鮮蒜表面，因此貯藏室內存放的鮮蒜之間必須留有一定的間隙，使臭氧充分發揮作用。臭氧處理作為一種殺菌保鮮方法[28]，也有其局限性，表現在以下幾方面：一是當果蔬處于密封包裝情況下，冷庫使用臭氧保鮮機保鮮時效果并不太理想；二是由于高濃度臭氧對人的眼睛、皮膚、呼吸道具有極強的刺激作用[29]，所以貯藏室的消毒應在無人的情況下進行；三是臭氧濃度并不是越高越好，臭氧使用濃度太大，會引起果蔬表面質膜損害，使其透性增大、細胞內物質外滲，導致品質下降，甚至加速果蔬的衰老和腐敗等[30]。

本試驗從0℃下貯藏后期鮮蒜上分離鑒定出3種致病菌，分別為交鏈孢屬（Alternaria）、產黃青霉（Penicilliumchrysogenum）和斜鏈擬青霉（Paccilomyces cateniobliquusLiang），且根據發病情況確定交鏈孢霉是貯藏期鮮蒜的主要致病菌。在0℃下，21.44 mg/m3臭氧處理抑制交鏈孢霉生長比17.152 mg/m3臭氧處理更加明顯；而在25℃下，17.152 mg/m3臭氧處理組卻比21.44 mg/m3組抑制效果好。當處理環境溫度相同，臭氧處理濃度也相同的情況下，處理12 h比處理18 h對霉菌的生長速度抑制效果要好。且在臭氧濃度相同、處理時間也相同的情況下，0℃組比25℃組交鏈孢霉生長情況得到更加明顯的抑制。可見，溫度對鮮蒜上交鏈孢霉抑菌效果的影響很大。本試驗結果顯示，0℃下21.44 mg/m3臭氧處理12 h對鮮蒜中主要病原菌交鏈孢霉的抑菌效果最好。