西南冷涼高地鮮切馬鈴薯抗褐變研究

程立君，王世敏,*，李 周，程金朋，劉健君，余平蓮

（1.昭通學院農學與生命科學學院，云南 昭通 657000；2.昭通市農業科學研究院，云南 昭通 657000）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界第四大糧食作物，富含維生素、礦物質、膳食纖維等成分，具有豐富的營養和良好的保健功能[1]。我國是世界馬鈴薯第一生產大國，種植面積和總產量均占全世界的20%左右[2]，目前形成了東北、華北、西北、南方和西南冷涼地區五大馬鈴薯主產區，其中西南冷涼地區因高海拔冷涼的氣候環境和云貴高原得天獨厚的紅土資源，所產的馬鈴薯中淀粉和干物質含量高，質量較好[3]，適用于鮮食和加工。近年來，以馬鈴薯主糧化和產業扶貧為契機，西南地區馬鈴薯產業快速發展[4]，尤其是馬鈴薯主食化、鮮切等加工需求迅速增長，但是針對西南冷涼高地馬鈴薯的保鮮研究相對滯后。在馬鈴薯加工過程（如削皮、切片、粉碎）中，由于機械損傷導致代謝活動增強，氧化應激反應增加，同時組織暴露于空氣表面與氧氣接觸，從而容易發生褐變[5]。鮮切馬鈴薯的褐變導致外觀不佳、品質下降以及水分和養分的流失[6]，影響產品的生產和銷售，并阻礙了深加工產品的進一步發展[7]。

鮮切馬鈴薯的褐變通常是由多酚氧化酶（PPO）引起的酶促褐變[8]。多酚氧化酶是一種含有兩個銅原子（CuA）的3型銅蛋白，在分子氧存在下，PPO可催化單酚酶羥基化和鄰二酚氧化為鄰醌，隨后醌類化合物被氧化成醌衍生物，形成的鄰醌與其他醌、氨基酸、蛋白質非酶聚合形成黑色化合物，導致酶促褐變[9]，并且不同品種馬鈴薯的多酚氧化酶活性存在差異[10-11]。因此，如何有效抑制多酚氧化酶活性是西南冷涼高地鮮切馬鈴薯產業發展的迫切需要。

通過調節pH和溫度等物理方法可以降低多酚氧化酶活性，從而控制馬鈴薯褐變的程度[12]，但是這些操作同時也容易導致馬鈴薯營養成分的損失。因此，本研究選擇檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈣4種添加劑進行復配，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法研究其不同比例復配后對鮮切馬鈴薯的護色效果，最終獲得對鮮切馬鈴薯褐變抑制效果最佳的組合，為鮮切馬鈴薯的護色保鮮提供參考，以期為高原特色馬鈴薯產品的開發提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

試驗用馬鈴薯品種為昭薯ZT032，由昭通市農業科學院提供。挑選新鮮、大小基本一致、無病蟲害和機械損傷的馬鈴薯，4℃條件下貯存，備用。

磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、亞硫酸氫鈉、氯化鈣、鄰苯二酚、檸檬酸、D-異抗壞血酸鈉：均為國產分析純；L-半胱氨酸：生化試劑。

1.1.2 儀器與設備

AX224ZH/E型精密電子天平，奧豪斯儀器有限公司；759型可見分光光度計，上海奧譜勒儀器有限公司；HL/T20MM型高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；BGZ140型干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗設計

1.2.1.1 檸檬酸對鮮切馬鈴薯護色的影響

新鮮馬鈴薯清洗、去皮后，切成厚度為3 mm的薄片，于濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的檸檬酸溶液中浸泡護色20 min后，考察其對馬鈴薯片PPO活性抑制率的影響。

1.2.1.2 L-半胱氨酸對鮮切馬鈴薯護色的影響

新鮮馬鈴薯清洗、去皮后，切成厚度為3 mm的薄片，于濃度分別為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%的L-半胱氨酸溶液中浸泡護色20 min后，考察其對馬鈴薯片PPO活性抑制率的影響。

1.2.1.3 D-異抗壞血酸鈉對鮮切馬鈴薯護色的影響

新鮮馬鈴薯清洗、去皮后，切成厚度為3 mm的薄片，于濃度分別為0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的D-異抗壞血酸鈉溶液中浸泡護色20 min后，考察其對馬鈴薯片PPO活性抑制率的影響。

1.2.1.4 氯化鈣對鮮切馬鈴薯護色的影響

新鮮馬鈴薯清洗、去皮后，切成厚度為3 mm的薄片，于濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的氯化鈣溶液中浸泡護色20 min后，考察其對馬鈴薯片PPO活性抑制率的影響。

1.2.2 響應面法優化鮮切馬鈴薯護色劑配方試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法優化檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣配比，得到最優的馬鈴薯褐變抑制劑復合配方，并對該結果進行驗證。

1.2.3 多酚氧化酶的提取及酶活性抑制率的測定

參考李利華[13]的方法，加以改進。稱取不同處理后的馬鈴薯樣品5 g，加入預冷的pH 6.0的磷酸緩沖溶液10 mL，在冰水浴中研磨成勻漿后，轉入至25 mL容量瓶中，用已預冷的pH 6.0磷酸緩沖溶液定容至25 mL，混勻后4℃下浸提10 min，取出后以4℃、10 000 r/min離心30 min，離心后得到的上清液即為多酚氧化酶粗酶液。

參考李利華[13]的方法，采用比色法，取4℃冷藏的0.1 mol/L磷酸緩沖溶液4 mL及0.1 mol/L鄰苯二酚溶液1.0 mL，再加入多酚氧化酶粗酶液0.5 mL，混勻后在波長420 nm處測定吸光值（OD值），從加入酶液開始計時，以不加酶液作為參比溶液每隔30 s記錄1次OD值的變化。選取吸光度-時間曲線中線性部分確定反應時間和計算酶活性抑制率[14]。酶活性抑制率為經抑制劑處理后酶的催化活性下降的百分數[15]。

式中：IE為酶活性抑制率，%；ΔA0為未處理對照樣品在反應時間內吸光度變化值；ΔA1為處理樣品在反應時間內吸光度變化值。

1.2.4 數據處理

單因素試驗結果采用SPSS（version 20.0）軟件對試驗數據進行處理和統計分析；響應面設計和數據分析采用Design Expert（version10.0）進行。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸對鮮切馬鈴薯護色效果的影響

檸檬酸是一種重要的有機酸，因具有螯合作用和調節pH的特性，在食品加工中能提高抗氧劑的性能，抑制酶活性，延長食品保存期[16]。由圖1可知，檸檬酸對PPO活性有明顯的抑制效果。隨著檸檬酸添加量的升高，對PPO活性的抑制率逐漸增加，當添加量達到0.5%時，酶活性抑制率達到62.03%，之后檸檬酸添加量繼續升高，但PPO活性的抑制率基本保持穩定，這與劉麗等[17]的研究結果較一致。分析原因可能因為檸檬酸對PPO活性中心的銅離子具有較強的螯合作用，破壞了活性中心，使PPO活性受到抑制[18]，另外隨著檸檬酸濃度的升高，溶液的pH值逐漸下降，使得反應體系的pH值遠離PPO的最適pH值，進一步導致PPO的結構被破壞，從而失活[19]。但檸檬酸達到一定濃度后，反應底物也受到了檸檬酸的抑制，在同一時間也會對酶的活性中心進行競爭[20]，導致雖然濃度繼續增加，但效果不明顯。因此，試驗選擇檸檬酸濃度0.5%作為響應面Box-Benhnken設計中零水平的中心點。

圖1 檸檬酸添加量對PPO活性抑制率的影響Fig.1 Effects of citric acid additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.2 L-半胱氨酸對鮮切馬鈴薯護色效果的影響

L-半胱氨酸為含硫氨基酸之一，屬非必需氨基酸，能直接與酶促反應產物醌類物質結合生成無色的硫氫化合物，從而抑制褐變的發生[21]。由圖2可見，L-半胱氨酸對PPO活性有明顯的抑制作用，隨著L-半胱氨酸添加量的升高，其對PPO活性的抑制率逐漸升高，當添加量達到0.25%時，酶活性抑制率達到61.10%；達到一定濃度后，繼續增加L-半胱氨酸添加量，酶活性抑制率變化不明顯。原因可是由于高濃度的L-半胱氨酸溶液在馬鈴薯組織中傳質受阻，從而影響L-半胱氨酸向鮮切馬鈴薯的浸透[22-23]，L-半胱氨酸抑制鮮切馬鈴薯PPO活性的最佳添加量為0.25%。因此，選擇L-半胱氨酸添加量0.25%作為響應面Box-Benhnken設計中零水平的中心點。

圖2 L-半胱氨酸添加量對PPO活性抑制率的影響Fig.2 Effects of L-cysteine additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.3 D-異抗壞血酸鈉對鮮切馬鈴薯護色效果的影響

D-異抗壞血酸鈉又名赤藻糖酸鈉，具有極強的還原性，是一種新型生物型食品抗氧防腐保鮮助色劑，能抑制果蔬氧化酶類的活性，防止褐變現象的發生，對保持果蔬的外觀色澤和風味品質均有很大作用[24]。由圖3可知，D-異抗壞血酸鈉對鮮切馬鈴薯PPO活性有顯著的抑制作用，因為D-異抗壞血酸鈉能夠作用于多酚氧化酶中心的銅離子，鈍化酶活性，同時能還原被酚酶氧化的酚類物質，抑制褐變進程[25]。試驗結果表明，隨著D-異抗壞血酸鈉添加量的升高，其對PPO活性的抑制率逐漸升高，當添加量達到0.04%時，酶活性抑制率達到77.26%，抑制效果明顯。但當D-異抗壞血酸鈉添加量超過0.04%后，酶活性抑制率變化不明顯。因此，選擇D-異抗壞血酸鈉添加量0.04%作為響應面Box-Benhnken設計中零水平的中心點。

圖3 D-異抗壞血酸鈉添加量對PPO活性抑制率的影響Fig.3 Effects of D-sodium isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.4 氯化鈣對鮮切馬鈴薯護色效果的影響

氯化鈣常作為食品添加劑，能使可溶性果膠凝固為凝膠狀不溶性果膠酸鈣，保持果蔬加工制品的脆度和硬度，同時Ca2+能夠抑制PPO活性，從而延緩褐變的發生[26-27]。由圖4可知，氯化鈣對鮮切馬鈴薯PPO活性具有一定的抑制作用，這可能是因為Ca2+與PPO中具有羧基的化合物結合，從而降低PPO活性[28]。隨著氯化鈣濃度的升高，對PPO活性的抑制率逐漸升高，當添加量達到0.6%時，抑制率為36.09%，抑制效果明顯。當氯化鈣添加量超過0.6%后，濃度繼續升高，酶活性抑制率變化趨于平緩，單獨使用氯化鈣作抑制劑時效果并不十分理想，有必要與其他抑制劑同時使用，通過交互作用增加抑制效果。因此，本試驗選擇氯化鈣添加量0.6%作為響應面Box-Benhnken設計中零水平的中心點。

圖4 氯化鈣添加量對PPO活性抑制率的影響Fig.4 Effects of calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.5 響應面法優化鮮切馬鈴薯護色劑配方試驗結果

2.5.1 Box-Behnken設計與結果

根據單因素試驗結果，利用Design Expert軟件進行Box-Behnken響應面中心組合試驗設計，以檸檬酸添加量、L-半胱氨酸添加量、D-異抗壞血酸鈉添加量、氯化鈣添加量4個因素為自變量，以PPO活性抑制率為響應值，進行四因素三水平響應面試驗分析，優化褐變抑制劑的配方，響應面試驗因素水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factor and level of response surface experiment

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

2.5.2 多元二次回歸方程擬合及方差分析

利用Design Expert軟件對表2試驗結果進行多元二次回歸方程擬合，通過響應面回歸過程進行數據分析，建立回歸模型，得到回歸方程：

回歸模型方差分析結果見表3。由表3可知，回歸方程極顯著（F=10.58，P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.279 8＞0.05），表明該模型有很好的擬合度，能將檸檬酸添加量、L-半胱氨酸添加量、D-異抗壞血酸鈉添加量和氯化鈣添加量4個因素對鮮切馬鈴薯護色效果進行準確的預測。方差分析結果表明：一次項B，交互項BC、BD，二次項A2、B2、D2對PPO活性抑制率的影響極顯著（P＜0.01），一次項C對PPO活性抑制率的影響顯著（P＜0.05），交互項AB、AC、AD對PPO活性抑制率的影響不顯著；各因素對多酚氧化酶活性抑制率影響的順序為：B（L-半胱氨酸添加量）＞C（D-異抗壞血酸鈉添加量）＞D（氯化鈣添加量）＞A（檸檬酸添加量）。

表3 響應面回歸模型方差分析結果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.5.3 響應曲面圖分析

各因素交互作用對鮮切馬鈴薯PPO活性抑制率的影響見圖5～10。每個響應曲面圖代表兩個自變量之間的相互作用對PPO活性抑制率的影響。通過對圖5～10的分析可知，除了BC（圖8）BD（圖9）的響應面圖陡峭，等高線呈橢圓形，表明其交互作用極顯著（P＜0.01），其他兩兩因素交互作用的響應面圖較平緩，等高線均呈橢圓形，隨著檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣水平的增加，酶活性抑制率變化均呈現先增加后下降的變化趨勢，表明選擇合適的檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣添加量對抑制多酚氧化酶活性至關重要。

圖5 檸檬酸和L-半胱氨酸添加量的交互作用對酶活性抑制率影響的響應面圖Fig.5 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and L-cysteine additions on the inhibitory rates of PPO activities

圖8 L-半胱氨酸和D-異抗壞血酸鈉添加量的交互作用對酶活性抑制率影響的響應面圖Fig.8 Response surface plot showing the interaction effects of L-cysteine and sodium D-isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

圖9 L-半胱氨酸和氯化鈣添加量的交互作用對酶活性抑制率影響的響應面圖Fig.9 Response surface plot showing the interaction effects of L-cysteine additions and calcium chloride on the inhibitory rates of PPO activities

2.5.4 褐變抑制劑配比的確定

在獲得非線性回歸模型和響應面分析的基礎上，得出酶活性抑制率的最佳條件為：檸檬酸添加量0.47%，L-半胱氨酸添加量0.28%，D-異抗壞血酸鈉添加量0.05%，氯化鈣添加量0.54%，該條件下酶活性抑制率預測值為95.84%。為驗證模型預測的可靠性，在此最優配比條件下，進行3組平行驗證試驗。結果表明，酶活性抑制率的平均值為95.13%，與預測值相比，兩者的相對誤差為0.71%，誤差較小，說明該模型可以很好地反映酶活性抑制率與各褐變抑制劑添加量的關系，利用響應面法優化褐變抑制劑添加量配比的研究是可靠的。

圖6 檸檬酸和D-異抗壞血酸鈉添加量的交互作用對酶活性抑制率影響的響應面圖Fig.6 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and D-sodium isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

圖7 檸檬酸和氯化鈣添加量的交互作用對酶活性抑制率影響的響應面圖Fig.7 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

圖10 D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣添加量的交互作用對酶活性抑制率影響的響應面圖Fig.10 Response surface plot showing the interaction effects of sodium D-isoascorbate and calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

3 結論

試驗選擇西南冷涼高地種植的馬鈴薯品種昭薯ZT032為護色試驗品種，通過添加護色劑抑制鮮切馬鈴薯中多酚氧化酶活性，減少褐變發生。單因素試驗中研究了單一檸檬酸、L-半胱氨酸、D-異抗壞血酸鈉和氯化鈣對鮮切馬鈴薯的護色效果，并在此基礎上采用響應面法進行復配研究。結果發現，復合護色劑對多酚氧化酶的酶活性抑制率效果優于單一護色劑的效果。采用響應面優化試驗得到西南冷涼高地鮮切馬鈴薯護色劑的最佳添加量配比為：檸檬酸0.47%，L-半胱氨酸0.28%，D-異抗壞血酸鈉0.05%，氯化鈣0.54%，此時PPO的酶活性抑制率為95.13%，與模型預測值的相對誤差僅為0.71%。該研究對高原特色鮮切馬鈴薯等產品的開發具有一定的應用價值。