DLEU2靶向miR-30d-5p影響舌鱗癌細胞增殖和凋亡的分子機制

付娟 李娜 袁清敏

(1河南護理職業學院口腔醫學系，河南 安陽 455000；2安陽市口腔醫院修復科)

舌鱗狀細胞癌(TSCC)屬于頭頸部惡性腫瘤之一，其具有惡性程度高、高復發轉移率等病理特征，由于其具有較強的侵襲性導致患者預后不良，嚴重時還可能出現局部擴散及遠處轉移等〔1，2〕。因而積極探尋TSCC發生機制對早期診斷及改善患者預后均具有重要臨床意義。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種長度超過200 nt的非編碼RNA分子，研究表明LncRNA表達異常與TSCC細胞增殖密切相關，并可能作為TSCC生物標志物及靶向治療靶點〔3〕。相關研究用芯片分析法獲得TSCC細胞癌組織和正常舌組織中差異表達的LncRNA，結果發現LncRNA DLEU2在TSCC細胞中下調表達〔4〕。研究表明DLEU2在宮頸癌組織及細胞中下調表達，過表達DLEU2可抑制癌細胞增殖、遷移能力〔5〕。DLEU2還可通過調控miR-16-1信號通路而影響喉癌細胞遷移、侵襲能力〔6〕。但DLEU2對TSCC細胞生物行為的影響及其機制目前還不清楚。研究表明TSCC組織中微小RNA-30d-5p(miR-30d-5p)的表達量顯著高于癌旁組織，且miR-30d-5p的表達量與患者TNM分期、分化程度和頸淋巴結轉移有關，抑制miR-30d-5p表達可有效抑制TSCC細胞增殖、遷移、侵襲能力〔7〕。通過生物信息學軟件預測到miR-30d-5p可能是DLEU2作用的靶基因，DLEU2是否可通過調控miR-30d-5p表達進而參與TSCC發生及發展過程尚未可知。因此本研究對TSCC組織中DLEU2的表達進行分析，構建DLEU2過表達載體上調TSCC Tca8113細胞中DLEU2的表達，探討其對TSCC細胞增殖及凋亡的影響，并分析其對miR-30d-5p的調控作用，以期為TSCC早期診斷及靶向治療奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1實驗對象 選取2015年3月至2016年4月安陽市口腔醫院修復科收治的TSCC患者26例為研究對象，所有患者經手術病理證實為TSCC，男15例，女11例，年齡為60～70歲，平均為(65.32±3.26)歲，收集患者臨床病理資料，TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期11例，Ⅲ～Ⅳ期15例；分化程度：低分化10例，中分化6例，高分化10例；淋巴結轉移10例，未發生淋巴結轉移16例。納入標準：所有患者術前未接受放療或化療；臨床資料完整。排除標準：合并其他惡性腫瘤；既往手術史者；患有嚴重代謝性疾病者。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者及家屬知情且簽署同意書。于術中切取TSCC組織及其癌旁組織(>5 cm)，迅速放于液氮中，術后將組織標本存放于-80℃超低溫冰箱保存。

1.1.2材料與試劑 TSCC細胞Tca8113購自中國科學院細胞庫。RPMI1640培養基、胰蛋白酶-EDTA、Lipofectamine2000轉染試劑均購自美國Invitrogen公司；胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合溶液均購自美國Hyclone公司；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒與實時熒光定量-聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司；miR-30d-5p mimics及其陰性對照序列均購自上海博亞生物技術有限公司；pcDNA3.1與si-DLEU2及其陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購自美國Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自華阜康生物科技股份有限公司；B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關x蛋白(Bax)、細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21抗體均購自美國CST公司；雙熒光素酶報告基因檢測系統購自美國Progema公司；細胞裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒與電化學(ECL)發光液均購自中國碧云天生物技術研究所；辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養、轉染及分組 將TSCC Tca8113細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基，放入含有5%CO2的37℃恒溫培養箱進行培養，當細胞融合度達80%左右時用胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養。取對數生長期細胞，使用Lipofectamine2000轉染試劑盒進行轉染，根據轉染物不同對Tca8113細胞進行分組：pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1序列)；pcDNA3.1-DLEU2組(轉染DLEU2過表達載體)；si-DLEU2組(轉染DLEU小干擾RNA序列)；si-NC組(轉染DLEU陰性對照序列)；pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組(共轉染DLEU2過表達質粒與miR-30d-5p陰性對照)；pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組(共轉染DLEU2過表達質粒與miR-30d-5p mimics)。轉染6 h后將培養基更換為含有10%胎牛血清的RPMI1640完全培養基，放入含有5%CO2的37℃恒溫培養箱繼續培養48 h。

1.2.2qRT-PCR檢測DLEU2、miR-30d-5p的表達 取凍存TSCC組織及癌旁組織標本，剪碎后研磨，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，使用RNA提取試劑盒提取組織總RNA。細胞RNA提取方法：收集各組轉染后TSCC Tca8113細胞，用胰蛋白酶消化后加入細胞裂解液，冰上裂解30 min后提取細胞總RNA。核酸微量檢測儀檢測RNA濃度與純度，參照反轉錄試劑盒將RNA合成cDNA，以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應條件為95℃ 5min循環1次，95℃ 30 s循環38次，60℃ 30 s循環38次，72℃ 30 s循環38次。每個樣品均設置3個復孔，采用2-ΔΔCt法計算DLEU2、miR-30d-5p的相對表達量。

1.2.3MTT比色法檢測細胞增殖 取轉染后各組Tca8113細胞，胰蛋白酶消化細胞，制備細胞懸浮液，調整細胞密度至3×105個/ml，以每孔1×105個細胞的密度接種于96孔板，分別于培養24 h、48 h、72 h時各孔分別加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液20 μl，室溫孵育4 h，棄上清，分別加入150 μl DMSO溶液，振蕩10 min，放入酶標儀檢測各孔光密度值(OD)，檢測波長為490 nm，每組均設置3次重復。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集各組對數生長期Tca8113細胞，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞，胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為1×105個/ml，以每孔1×105個細胞的密度接種于6孔板，加入100 μl結合緩沖液重懸細胞，分別加入5 μl濃度為250 ng/L的膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)與濃度為250 ng/L的碘化丙啶(PI)5 μl，室溫避光孵育20 min，加入400 μl結合緩沖液，于1 h內在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.2.5Western印跡檢測CyclinD1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達 取轉染后各組Tca8113細胞，預冷PBS洗滌細胞，加入100 μl細胞裂解液，4℃條件下裂解30 min，4℃條件下12 000 r/min轉速離心10 min提取蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，以每泳道30 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應，將分離的蛋白凝膠轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入蛋白一抗(1∶1 000)，置于搖床孵育24 h(溫度為4℃)，TBST洗膜后再與二抗(1∶2 000)室溫下孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影，用凝膠成像系統及Quantityone軟件檢測條帶灰度值。

1.2.6雙熒光素酶報告基因實驗 利用在線數據庫預測DLEU2的3′UTR存在miR-30d-5p的結合位點，用PCR將DLEU2與miR-30d-5p的結合位點序列進行克隆，構建重組熒光素酶報告基因質粒pGL3-DLEU2-3′UTR(WT-DLEU2)；將DLEU2中預測結合片段改變，構建pGL3-DLEU2-3′UTR-mut(MUT-DLEU2)突變體報告載體，用雙酶切電泳鑒定構建載體。參照Lipofectamine2000轉染試劑將WT-DLEU2、MUT-DLEU2報告載體與miR-30d-5p mimics或陰性對照共轉染至TSCC Tca8113細胞，轉染48 h后根據熒光素酶檢測試劑盒檢測細胞熒光素酶活性。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1DLEU2在TSCC組織和對應癌旁組織中的表達 DLEU2在TSCC組織中的表達水平(0.27±0.02)較癌旁組織(0.82±0.08)明顯降低(P<0.05)。

2.2過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的影響 與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組Tca8113細胞中DLEU2表達水平明顯升高(P<0.05)，提示轉染效率良好。過表達DLEU2可顯著降低細胞增殖活性(P<0.05)，表明DLEU2過表達可明顯抑制TSCC細胞增殖。與pcDNA3.1組相比，pcDNA3.1-DLEU2組ca8113細胞中CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，p21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，表明DLEU2過表達可通過抑制CyclinD1蛋白表達及促進p21蛋白表達進而抑制TSCC細胞增殖。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖蛋白表達的影響

表1 過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的影響

2.3過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響 與pcDNA3.1組比較，過表達DLEU2后TSCC Tca8113細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)，表明DLEU2過表達可促進TSCC細胞凋亡。pcDNA3.1-DLEU2組TSCC Tca8113細胞中Bax表達水平較pcDNA3.1組顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)。表明DLEU2過表達可通過促進Bax表達及抑制Bcl-2表達進而促進TSCC細胞凋亡。見圖2、圖3、表2。

圖2 過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡蛋白表達的影響

表2 過表達DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響

2.4DLEU2靶向、調控miR-30d-5p 生物信息學方法檢測得出miR-30d-5p可能是DLEU2的直接作用靶點，見圖4。通過雙熒光素酶報告基因實驗分析可知，與miR-NC組比較，miR-30d-5p過表達可明顯降低WT-DLEU2野生型組細胞熒光素酶活性(P<0.05)；而MUT-DLEU2突變型組miR-30d-5p過表達后細胞熒光素酶活性與陰性對照相比無明顯變化(P>0.05)，見表3。表明DLEU2能夠結合miR-30d-5p而影響其活性。轉染si-DLEU2的Tca8113細胞中miR-30d-5p表達水平(1.17±0.10)顯著高于轉染si-NC(0.88±0.09，P<0.05)，而轉染pcDNA3.1-DLEU2后miR-30d-5p的表達(0.53±0.05)明顯降低(P<0.05)。表明DLEU2可通過吸附miR-30d-5p而負向調節其表達。

圖4 DLEU2靶向miR-30d-5p

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.5過表達miR-30d-5p能逆轉DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的影響 共轉染pcDNA3.1-DLEU2與miR-30d-5p mimics后Tca8113細胞增殖活性較pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組明顯升高(P<0.05)，促進CyclinD1表達(P<0.05)，明顯抑制p21表達(P<0.05)。表明過表達miR-30d-5p可逆轉DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的抑制作用。見圖5，表4。

1～2：pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組、pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組，下圖同圖5 過表達miR-30d-5p能逆轉DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖蛋白表達的影響

表4 過表達miR-30d-5p能逆轉DLEU2對TSCC細胞Tca8113增殖的影響

2.6過表達miR-30d-5p能逆轉DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響 相較于pcDNA3.1-DLEU2+miR-NC組，pcDNA3.1-DLEU2+miR-30d-5p組Tca8113細胞凋亡率顯著降低，Bax表達水平顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2表達水平顯著升高(均P<0.05)，見表5、圖6。表明過表達miR-30d-5p可逆轉DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的促進作用。

圖6 過表達miR-30d-5p能逆轉DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡蛋白表達的影響

表5 過表達miR-30d-5p能逆轉DLEU2對TSCC細胞Tca8113凋亡的影響

3 討 論

晚期TSCC患者生存率極低，由于舌組織富含大量血管及淋巴管導致患者常伴有局部擴散及轉移，嚴重降低患者生活質量〔8〕。研究表明miRNA與TSCC發生及發展密切相關，但仍有部分miRNA對TSCC細胞惡性生物學行為的影響尚未可知〔9〕。LncRNA可作為miRNA的海綿分子競爭性吸附其與靶基因的結合位點進而間接調控靶基因表達從而調控腫瘤細胞增殖、分化等生物學進程〔10〕。

DLEU2在胰腺癌細胞中呈高表達，沉默DLEU2表達后可通過上調miR-455表達進而抑制胰腺癌細胞增殖及遷移〔11〕。DLEU2屬于miR-15a/16-1簇的宿主基因，其可通過調控miR-15a/16-1表達而調控轉錄核因子(NF)-κB信號通路進而抑制腫瘤發生及發展〔12〕。這可能由于腫瘤細胞惡性程度及組織部位不同導致DLEU2的表達及其作用效果不同。研究報道指出DLEU2缺失可導致慢性淋巴細胞性白血病及其他腫瘤發生〔13～15〕。本研究結果說明DLEU2在TSCC發生過程中可能發揮抑癌基因作用。研究報道指出細胞增殖周期中CyclinD1是調控細胞增殖信號的主要蛋白，其可激活CDK4/CDK6進而正向調控細胞周期，p21是CDK抑制因子并可抑制CDK4/CDK6激活進而抑制細胞增殖〔16〕。細胞凋亡過程中涉及多種基因調控，其中Bax、Bcl-2是調控細胞凋亡的主要基因，Bcl-2是抗凋亡基因，Bax是促凋亡基因，Bax表達水平升高可抑制Bcl-2的作用進而抑制細胞凋亡〔17〕。本研究結果提示DLEU2可能作為TSCC靶向治療的潛在靶點。miR-30d-5p在宮頸癌患者外泌體中呈高表達，并可作為臨床診斷宮頸癌的重要輔助標志物〔18〕。miR-30d-5p在非小細胞肺癌組織及細胞中均呈低表達，其可通過靶向抑制CCNE2基因表達進而減弱非小細胞肺癌細胞增殖活力〔19〕。分析原因可能為不同腫瘤組織或細胞中miR-30d-5p的表達不同。研究表明前列腺癌組織及細胞中miR-30d-5p的表達水平均顯著降低，上調miR-30d-5p表達可通過靶向調控NT5E表達進而抑制前列腺癌細胞增殖和遷移〔20〕。本研究結果提示DLEU2可通過抑制miR-30d-5p表達而促進TSCC細胞凋亡并抑制其增殖進而參與TSCC發生及發展過程。