雷公藤多甙通過調控miR-146a表達來減輕LPS誘導的AR42J細胞炎癥損傷

蒙振發 李以萍 譚德敏 陳綿軍 陳軍

(儋州市人民醫院 1重癥醫學科，海南 儋州 571700；2門診藥房)

急性胰腺炎(AP)是臨床上常見的急性腹癥，臨床一般表現為腹痛、惡心嘔吐、發熱、血胰酶升高等癥狀，具有起病迅速、病死率高、預后差等特點，除胰腺本身病變外，還可引發其他組織和器官損傷，甚至誘發患者全身性炎癥反應和器官功能性障礙〔1～3〕。脂多糖(LPS)即熱源或內毒素，是革蘭陰性菌細胞壁的成分，具有毒性、炎癥損傷作用，能誘發機體的免疫反應。雷公藤多甙(TWP)是衛矛科植物雷公藤去皮根中提取而成的總皂苷，其中二萜類化合物和雷公藤甲素發揮主要作用，臨床上應用于免疫調控、抗炎、腎病等，其不良反應少、用量小，是目前國內外研究免疫調節、抗炎藥的熱點之一〔4〕。微小RNA(miRNA)是內源性非編碼RNA，在炎癥、免疫調節方面發揮著重要作用，大部分miRNA通過抑制基因表達，發揮負反饋調節作用，miR-146是最先發現在免疫應答中具有正反饋調節作用的miRNA，有miR-146a和miR-146b兩個成員〔5〕。miR-146b在炎癥反應中已被廣泛研究報道，因此本研究以胰腺腺泡細胞(AR42J)為模型細胞，擬通過研究TWP在減輕LPS誘導的AR42J炎癥損傷中的作用及對miR-146a表達的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 TWP(≥98%)購自湖北恒景瑞化工有限公司；地塞米松(DXM) 磷酸鈉注射液購自湖北天藥藥業股份有限公司(1 ml∶5 mg)；LPS(≥99%)購自上海酶聯生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibico公司；青鏈霉素雙抗、四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑購自美國Hyclone公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-1β酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自美國Neomarker公司；總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；U6內參(E021010)購自美國EARTHOX公司；miR-146a PCR引物(CD106)購自北京天根生化科技有限公司；兔抗鼠NF-κB p65、兔抗鼠Toll樣受體(TLR)4、兔抗鼠內參β-Actin、羊抗兔二抗購自美國Bioworld公司；CFX96型實時熒光定量(RT-qPCR)儀購自美國BIO-RAD公司；Multiskan FC酶標儀、賽默飛世爾BB15 CO2細胞培養箱購自美國賽默飛公司；細胞培養接種專用超凈臺購自鄭州安晟科學儀器有限公司；電泳槽和轉膜槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞系 大鼠胰腺腺泡細胞(AR42J)購自中科院上海細胞庫，加入含10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養液，置于37℃ 5%CO2培養箱中常規培養，隔天換液。細胞生長至70%～80%融合后進行傳代。收集對數生長期細胞進行后續試驗。

1.3MTT法測定不同濃度TWP對AR42J細胞活性的影響 取對數生長期的AR42J細胞，用培養液將細胞密度調整為4×104個/ml，以每孔200 μl接種到96孔板，繼續培養過夜后棄培養液，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，加入含不同濃度的TWP培養液(終濃度分別為2、5、10、25、50、100 μmol/L)，每組設置6個復孔，同時設置不加TWP的對照組，只加0.1%二甲基亞砜(DMSO)組。培養箱培養24 h，之后加入25 μl 5 mg/ml的MTT溶液，繼續培養4 h，棄去培養基，加入150 μl DMSO溶液，100 r/min 37℃震蕩10 min，使用全自動酶標儀測定在490 nm處吸光度(OD值)。計算不同濃度TWP對AR42J細胞活性。細胞活性按下式計算：細胞活性(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.4LPS刺激后AR42J細胞形態學觀察 實驗分組，對照組：不經任何處理的AR42J細胞；LPS組：加入2 ml 終濃度為10 μg/ml LPS培養液〔6〕；L-TWP+LPS組：加入2 ml終濃度為10 μg/ml LPS和2 μmol/L TWP培養液(LPS加入24 h后，再加入TWP培養24 h，以下分組操作與此相同)；M-TWP+LPS組：加入2 ml終濃度為10 μg/ml LPS和5 μmol/L TWP培養液；H-TWP+LPS組：加入2 ml終濃度為10 μg/ml LPS和10 μmol/L TWP培養液；DXM+LPS組：加入2 ml終濃度為10 μg/ml LPS和25 μg/mL DXM培養液〔7〕。將AR42J細胞接種到含有細胞爬片的6孔板上，培養24 h后，按照上面分組進行加藥操作，待培養結束后染色、封片，用激光共聚焦觀察細胞形態并拍照。

1.5ELISA檢測TNF-α和IL-6表達水平 ELISA法檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6表達水平，將各孔的細胞培養基在4℃ 5 000 r/min離心半徑10 cm條件下離心10 min，用移液器取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定各組細胞TNF-α和IL-6表達水平，顯色后，用多功能酶標儀測定樣品在450 nm處的吸光度，根據建立的標準曲線計算TNF-α和IL-6濃度。

1.6RT-qPCR檢測細胞中miR-164a表達水平 收集AR42J細胞，實驗分組同“1.4”，使用總RNA提取試劑盒提取AR42J細胞中的總RNA，經過反轉錄得cDNA，采用RT-qPCR儀對miR-164a進行擴增。RT-qPCR體系共20.0 μl，其中SYBR Mix10.0 μl，cDNA(25 ng/ml) 2.0 μl，上下游引物(5 μmol/L)各2.0 μl，ddH2O 4.0 μl。反應條件：95℃預變性300 s，95℃變性30 s，63℃退火30 s，73℃延伸15 s，40個循環后，73℃終末延伸5 min。miR-164a上游引物:5′-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′，下游引物：5′-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU-3′；U6上游引物:5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。每個樣本均做3個副孔，采用2-ΔΔCt法對AR42J細胞miR-164a表達水平進行定量分析。

1.7Western印跡法測定TWP對AR42J細胞TLR4/核轉錄因子(NF)-κB信號通路的影響 Western印跡測定膠質瘤AR42J細胞NF-κB p65和TLR4表達情況，實驗分組同“1.4”。用細胞裂解液十二烷基硫酸鈉(SDS)提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定各組細胞蛋白含量，每組設置6個副孔，40 μg蛋白加入到點樣孔中，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離目標蛋白，根據目標蛋白大小剪切大小適當的凝膠。用濕轉法將凝膠上蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉封閉結合位點2 h。加入兔抗鼠NF-κB p65(1∶1 000)、兔抗鼠TLR4(1∶1 000)、兔抗鼠內參β-Actin(1∶1 000)4℃孵育過夜，用PBS清洗3次，每次5 min，加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，25℃孵育15 min，PBS清洗3次，每次5 min，用顯色劑電化學發光(ECL)顯色、曝光。用凝膠成像設備觀察。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1不同濃度TWP對AR42J細胞活性的影響 0 μmol/L、2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L TWP處理24 h后AR42J細胞活性，分別為：(102.67±3.31)%、(98.46±4.27)%、(94.27±3.64)、(87.59±4.06)%、(76.91±4.16)%、(52.47±3.94)%、(32.65±3.92)%。AR42J細胞經10 μmol/L TWP處理24 h后，仍保持較高活性，為保證實驗結果準確性，后續實驗選取TWP濃度2 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L進行。

2.2LPS刺激后AR42J細胞形態 AR42J細胞經LPS誘導后，細胞逐漸變形、皺縮、邊緣不規則、核仁不清晰，經不同濃度TWP處理后，隨著濃度增加細胞形態逐步恢復，細胞逐漸恢復圓整飽滿。見圖1。

圖1 LPS刺激后AR42J細胞形態(免疫熒光染色，×100)

2.3TWP對AR42J細胞促炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β表達的影響 與對照組相比，LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，L-TWP+LPS組、M-TWP+LPS組、H-TWP+LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，隨著TWP濃度升高，蛋白表達水平也隨之降低，任意兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)。DXM+LPS組TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達水平與LPS組、L-TWP+LPS組及M-TWP+LPS組相比顯著降低(P<0.05)，與H-TWP+LPS組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.4TWP對AR42J細胞中miR-146a水平的影響 與對照組相比，LPS組miR-146a表達水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，L-TWP+LPS組、M-TWP+LPS組、H-TWP+LPS組miR-146a表達水平顯著升高(P<0.05)，隨著TWP濃度升高，miR-146a表達水平也隨之升高，任意兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)。DXM+LPS組miR-146a表達水平與LPS組、L-TWP+LPS組及M-TWP+LPS組相比顯著升高(P<0.05)，與H-TWP+LPS組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.5TWP對AR42J細胞TLR4/NF-κB信號通路的影響 與對照組相比，LPS組NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與LPS組相比，L-TWP+LPS組、M-TWP+LPS組、H-TWP+LPS組NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，隨著TWP濃度升高，TNF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表達水平也隨之降低，任意兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)。DXM+LPS組NF-κB p65蛋白、TLR4蛋白表達水平與LPS組、L-TWP+LPS組及M-TWP+LPS組相比顯著降低(P<0.05)，與H-TWP+LPS組相比差異無統計學意義(P>0.05)，見表1和圖2。

表1 TWP對AR42J細胞TNF-α、IL-6、IL-1β表達及miR-146a、NF-κB p65、TLR4水平的影響

3 討 論

p38MAPK和核轉錄因子NF-κB是胰腺炎發病中產生促炎癥因子的主要途徑，有學者認為腸黏膜受損，導致腸道菌群細胞壁成分LPS刺激機體是胰腺炎發病的主要原因〔8,9〕。研究表明LPS可激活機體免疫系統分泌大量炎癥因子，從而引起炎癥損傷，在實驗性胰腺炎模型中，LPS刺激后上調TNF-α和IL-6等促炎癥因子的表達，而TNF-α和IL-6的上調以正反饋方式持續活化NF-κB通路，導致炎癥反應得以持續和放大〔10,11〕。本實驗細胞形態結果說明炎癥細胞模型構造成功。

TWP因其保留雷公藤的抗炎、免疫調節作用，去除毒性部分，在臨床上主要用于治療類風濕關節炎、皮肌炎、腎臟疾病、紅斑狼瘡等疾病〔12〕。TNF-α由非免疫或免疫細胞分泌的細胞因子，可與前炎癥因子共同啟動早期炎癥反應，并維持炎癥。IL-6是多效能的細胞因子，在炎癥和免疫調節中發揮著重要作用〔13,14〕。徐光標等〔15〕研究表明TWP能夠下調糖尿病腎病患者炎癥因子TNF-α和IL-6表達水平從而改善患者免疫失衡狀態，恢復腎臟功能，減少尿蛋白生成；進一步細胞實驗發現，TWP預處理可抑制LPS誘導的大鼠星形膠質細胞促炎癥因子TNF-α和IL-6釋放，說明TWP能夠改善LPS誘導的星形膠質細胞炎性損傷。本研究結果說明TWP能下調AR42J細胞促炎癥因子TNF-α、TNF-α和IL-1β的表達，減輕LPS所致AR42J細胞炎癥反應。

miRNA是目前生命科學研究的熱點之一，可促進mRNA降解或抑制翻譯，在轉錄水平上調控基因，最終影響下游蛋白分子的表達。研究表明miR-146a能夠通過負反饋調節TNF受體相關因子(TRAF)6和IL-1受體相關激酶(IRAK)1，降低NF-κB活性，從而進一步降低下游促炎因子的表達〔16〕。本研究結果說明TWP能夠上調炎癥AR42J細胞miR-146a表達水平來減輕炎癥損傷。周興宏等〔17〕發現三七皂苷R1可能通過上調miR-146a表達水平，降低TNF-α和IL-6表達水平，以降低動脈粥樣硬化小鼠血脂、血糖水平，并保護肝功能。隨后研究〔18〕發現在PM1誘導的炎癥BEAS-2B細胞中IL-6和IL-8表達水平上調，并通過激活NF-κB信號通路上調miR-146a的表達，過表達的miR-146a通過抑制IRAK1/TRAF6表達來阻止p65的核轉位，并下調IL-6和IL-8的表達，說明miR-146a可以通過BEAS-2B細胞中的NF-κB信號傳導途徑負調節PM1誘導的炎癥反應。本研究說明AR42J細胞經TWP處理后，TLR4/NF-κB信號通路受到抑制。

綜上所述，TWP可能通過上調miR-146a表達水平抑制TLR4/NF-κB信號通路，降低炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白表達水平，從而減輕LPS誘導的AR42J細胞炎癥損傷。