人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植治療大鼠心肌梗死

毛慶 梁秀琳 龐毅恒 盧永祥

(廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 1心內(nèi)科,廣西 南寧 530007；2神經(jīng)內(nèi)科)

急性心肌梗死(AMI)是致殘和致死的主要心血管疾病之一，其發(fā)病率逐年上升〔1〕。特別是心肌梗死面積較大患者的壞死心肌，在修復(fù)過程中形成不具有收縮功能的纖維性瘢痕，最終可能導(dǎo)致心律失常、心室功能障礙甚至梗死后充血性心力衰竭〔2〕。雖然心臟有內(nèi)源性修復(fù)系統(tǒng)，但其再生能力有限，不足以完全替代受損心肌組織，心肌損傷幾乎不可逆轉(zhuǎn)〔3〕。臨床上常用的經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和溶栓治療雖然可以改善心肌血液供應(yīng)，但不能產(chǎn)生功能性新生心肌細(xì)胞修復(fù)壞死心肌組織〔4〕。近年來，向心肌梗死部位注入干細(xì)胞，成為增強(qiáng)心肌修復(fù)能力、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的新策略〔5〕。

干細(xì)胞能夠分裂和分化成具有特殊功能的各種成熟細(xì)胞類型〔6〕。干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞，成體干細(xì)胞和多能干細(xì)胞〔7〕。體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞和多種來源的成體干細(xì)胞被成功誘導(dǎo)分化為有功能的心肌細(xì)胞，在植入部位和原有心肌整合，改善了心臟功能〔8～10〕。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是近年來從成體干細(xì)胞中制備獲得的多能干細(xì)胞，有著與胚胎干細(xì)胞相似的多向分化潛能，可分化為任意類型的細(xì)胞，卻沒有免疫原性和倫理學(xué)爭議〔11〕。國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的體外研究顯示其心肌定向分化效率不斷提高；移植治療心肌梗死的體內(nèi)研究則是將誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞先在體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞再移植至心肌梗死動物模型的心臟內(nèi)〔12〕。Ishida等〔13〕研究表明，來源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的心肌細(xì)胞移植治療豬心肌梗死在恢復(fù)心臟功能和耗氧量方面優(yōu)于來源于成體干細(xì)胞的心肌細(xì)胞。Templin等〔14〕應(yīng)用計算機(jī)斷層掃描對移植入大鼠心肌梗死模型中的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在進(jìn)行跟蹤，結(jié)果顯示在移植后的15 w內(nèi)細(xì)胞的存活、植入和分布達(dá)到了預(yù)期效果。本研究建立心肌梗死大鼠模型，將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞進(jìn)行移植的同時，也將未經(jīng)誘導(dǎo)分化的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞直接移植至心肌損傷部位，比較兩種細(xì)胞對心肌細(xì)胞損傷治療的效果。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物：12周齡SD大鼠，雌性，SPF級，體重(230±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2017-0033。細(xì)胞株：人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和CardioEasy?人心肌細(xì)胞購于北京賽貝生物技術(shù)有限公司。

主要儀器和試劑：PSCeasy?人多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)基、PSCeasy?人多潛能干細(xì)胞鋪底工作液、CardioEasy?心肌復(fù)蘇培養(yǎng)基、CardioEasy?人心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基、CaridoEasy?人心肌細(xì)胞消化液、PSCeasy?人多潛能干細(xì)胞消化液和PSCeasy?人多潛能干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)基購于北京賽貝生物技術(shù)有限公司；CM-DiI 活細(xì)胞染色劑購于美國Invitrogen公司；Masson三色染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；水合氯醛和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購于Sigma公司；兔抗大鼠CD31多克隆抗體、羊抗鼠IgG3-FITC購于美國Santa Cruz公司；CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺購于美國Thermo公司；光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡購于德國Leica公司。

1.2實驗方法

1.2.1SD大鼠心肌梗死模型的制備〔15〕40只SD大鼠禁食12 h，用氯胺酮(75 mg/kg體重)腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位，氣管插管連接呼吸機(jī)輔助通氣，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，自大鼠左胸第四肋間做橫切口打開胸腔，推開左肺，撕開心包膜，充分暴露左冠狀動脈，自左心耳下方2 cm處進(jìn)針，用8-0縫合線縫扎冠狀動脈左前降支，待結(jié)扎下方心肌大面積變白和室壁運動減弱，胸前放置引流軟管，逐層縫合關(guān)胸。造模成功的標(biāo)志〔16〕：造模72 h后進(jìn)行以下檢查，①心電圖結(jié)果顯示ST段抬高，Q波寬而深，T波倒置；②心臟彩超結(jié)果顯示左室射血分?jǐn)?shù)和左室縮短分?jǐn)?shù)降低。 造模過程中2只大鼠死亡，2只大鼠未達(dá)到造模成功標(biāo)準(zhǔn)，其余36只大鼠造模成功。另取12只SD大鼠只開胸、不結(jié)扎冠狀動脈作為假手術(shù)組。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)〔17〕已經(jīng)鑒定的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞用人多潛能干細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)基復(fù)蘇，用人多潛能干細(xì)胞鋪底工作液涂在培養(yǎng)皿底部，將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，用人多潛能干細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換液1次，待細(xì)胞生長融合達(dá)培養(yǎng)皿底部85%后用人多潛能干細(xì)胞消化液消化細(xì)胞進(jìn)行傳代；用心肌復(fù)蘇培養(yǎng)基復(fù)蘇已經(jīng)鑒定的人心肌細(xì)胞，將人心肌細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中用人心肌細(xì)胞維持培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日換液1次，待細(xì)胞生長融合達(dá)培養(yǎng)皿底部85%后用人心肌細(xì)胞消化液消化細(xì)胞進(jìn)行傳代。將傳至第3代的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和人心肌細(xì)胞用移植。

1.2.3實驗分組與細(xì)胞移植 將造模成功的36只SD大鼠隨機(jī)分為模型組、心肌細(xì)胞組和干細(xì)胞組，每組12只。①模型組：不予治療；②心肌細(xì)胞組：用第3代人心肌細(xì)胞移植；③干細(xì)胞組：用第3代的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞移植；④另取12只作為假手術(shù)組：不予治療。細(xì)胞移植方法：在移植前24 h，用CM-DiI 活細(xì)胞染色劑分別標(biāo)記人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和心肌細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，用PBS將人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和心肌細(xì)胞制成濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液，每只大鼠經(jīng)頸靜脈注射200 μl細(xì)胞懸液。

1.2.4冰凍切片觀察人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和心肌細(xì)胞的歸巢〔18〕移植2 w后，各組隨機(jī)選取3只大鼠，麻醉后快速取出心臟，切除結(jié)扎點水平以上的心房和部分心室，將剩余部分放入-80℃冰箱，快速冷凍30 min，用冰凍切片機(jī)連續(xù)切片，制成厚度為制作8 μm的冰凍切片，4%多聚甲醛固定1 h，DAPI染核5 min，放淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下用560 nm波長激光器激發(fā)綠色熒光、用405 nm波長激光器激發(fā)藍(lán)色熒光，觀察CM-DiI標(biāo)記的呈綠色熒光的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和人心肌細(xì)胞在心肌梗死部位的歸巢情況。每張切片選取有綠色熒光的5個低倍視野，用Image Pro6.0軟件測量視野中呈綠色熒光細(xì)胞的個數(shù)，計算平均值比較細(xì)胞歸巢情況。

1.2.5免疫熒光染色檢測細(xì)胞定植部位血管新生情況〔19〕移植4 w后，各組隨機(jī)選取3只大鼠，麻醉后快速取出心臟，切除結(jié)扎點水平以上的心房和部分心室，將剩余部分心肌放入4%多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)脫水和透明后常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片機(jī)連續(xù)切片。將制成的石蠟切片，PBS漂洗、烤片、脫蠟、水合，用10%山羊血清室溫封閉1 h，滴加兔抗大鼠CD31多克隆抗體(工作濃度1∶50)，4℃避光孵育12 h，次日去除抗體溶液，滴加羊抗鼠IgG3-FITC避光孵育45 min，抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。CD31陽性血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)紅色熒光，為了不影響CD31陽性細(xì)胞觀察未用DAPI染核。每張切片選取有紅色熒光的5個低倍視野，用Image Pro6.0軟件測量視野中呈紅色熒光細(xì)胞的平均光密度值，計算平均值比較血管新生情況。

1.2.6Masson染色觀察心肌纖維化情況〔20〕移植4 w后，取1.2.5中制作的石蠟切片，脫蠟、梯度乙醇水合、流水沖洗，1%地伊紅染液染色1 h，蒸餾水沖洗2 min，蘇木素染色5 min，蒸餾水沖洗2 min，麗春紅染液染色10 min，0.2%冰醋酸浸泡3 min，1%磷酸鋁溶液分化1 min，2%亮綠染液染色1 min，0.2%冰醋酸浸泡3 min，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察：膠原纖維被染成藍(lán)色、心肌纖維染成粉紅色。用Image Pro6.0軟件測量切片橫截面中心肌纖維化面積和心肌梗死面積，根據(jù)公式：心肌纖維化面積百分比(%)=心肌纖維化面積/心肌梗死面積×100%。

1.2.7心臟超聲檢測心功能變化情況〔22〕各組隨機(jī)選取3只大鼠，在移植4 w后，用心臟超聲診斷儀檢測各組大鼠心功能各項參數(shù)：左室收縮末期內(nèi)徑、左室舒張末期內(nèi)徑和左室射血分?jǐn)?shù)，連續(xù)檢測5個心動周期，取平均值進(jìn)行比較。

1.3觀察指標(biāo) ①移植細(xì)胞歸巢情況；②血管再生情況；③心肌纖維化情況；④心功能各項指標(biāo)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析，LSD檢驗，t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組移植細(xì)胞的歸巢情況比較 假手術(shù)組和模型組心肌梗死區(qū)域和非梗死區(qū)域未見綠色熒光，心肌細(xì)胞組和干細(xì)胞組心肌梗死區(qū)域可見點狀綠色熒光散在分布，見圖1，心肌細(xì)胞組歸巢細(xì)胞數(shù)量高于干細(xì)胞組(62.21個 vs 46.32個，P<0.05)。

圖1 各組心肌細(xì)胞冰凍切片的熒光顯微鏡觀察結(jié)果(×400)

2.2各組血管再生情況比較 假手術(shù)組心肌纖維間可見大量呈紅色熒光的CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞聚集成血管輪廓，模型組在梗死區(qū)域偶見紅色熒光的CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞，心肌細(xì)胞組在梗死區(qū)域可見呈紅色熒光的CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞散在分布，干細(xì)胞組在梗死區(qū)域可見較多呈紅色熒光的CD31陽性內(nèi)皮細(xì)胞成團(tuán)分布，見圖2。假手術(shù)組CD31陽性細(xì)胞的平均光密度值(0.096)明顯高于模型組、心肌細(xì)胞組和干細(xì)胞組(0.026、0.029、0.061，P<0.01)；干細(xì)胞組CD31陽性細(xì)胞的平均光密度值明顯高于模型組和心肌細(xì)胞組(P<0.01)；心肌細(xì)胞組CD31陽性細(xì)胞的平均光密度值高于模型組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組血管再生免疫熒光染色結(jié)果(×400)

2.3各組心功能比較 移植4 w后，模型組、心肌細(xì)胞組、干細(xì)胞組左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑明顯高于假手術(shù)組，而左室射血分?jǐn)?shù)明顯低于假手術(shù)組(P<0.05)；心肌細(xì)胞組、干細(xì)胞組左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑明顯低于模型組，而左室射血分?jǐn)?shù)明顯高于模型組(P<0.05)；干細(xì)胞組左室收縮末期內(nèi)徑和左室舒張末期內(nèi)徑明顯低于心肌細(xì)胞組，而左室射血分?jǐn)?shù)明顯高于心肌細(xì)胞組(P<0.05)。見表1。

表1 各組心功能比較

2.4各組心肌纖維化情況比較 見圖3。假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)正常，排列整齊的心肌細(xì)胞被染成紅色，未見心肌組織纖維化；模型組心肌梗死區(qū)域可見大量藍(lán)色膠原纖維取代了正常心肌結(jié)構(gòu)；心肌細(xì)胞組心肌梗死區(qū)域可見大量藍(lán)色膠原纖維填充；干細(xì)胞組心肌梗死區(qū)域可見藍(lán)色膠原纖維散在分布；干細(xì)胞組心肌纖維化面積(30.6%)明顯小于模型組和心肌細(xì)胞組(52.3%、41.2%，P<0.01)。

圖3 各組心肌纖維化Masson染色結(jié)果(×400)

3 討 論

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞均來源于自體細(xì)胞，但誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化效率高于間充質(zhì)干細(xì)胞，為心肌梗死的細(xì)胞移植等再生醫(yī)學(xué)提供了理想的種子細(xì)胞〔13，21〕。Ye 等〔22〕在體外將人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞后注射移植入心肌梗死豬模型心肌梗死邊緣區(qū)域，結(jié)果顯示移植的心肌細(xì)胞整合到了原有的心肌組織中，縮小了心肌梗死的面積，改善了心室功能。Zhang等〔23〕將人心肌成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞移植到心肌梗死模型小鼠心肌梗死區(qū)域4 w后，心肌梗死區(qū)域凋亡細(xì)胞減少，左室心肌收縮力增強(qiáng)。以上研究表明，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞直接注射到動物模型心肌梗死邊緣能促進(jìn)心肌損傷后的修復(fù)。但誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化效率一直制約其應(yīng)用〔24，25〕。祝因蘇等〔26〕直接將誘導(dǎo)多能干細(xì)胞注射移植到心肌梗死模型豬的心肌梗死損傷部位，縮小了梗死面積并改善了心肌收縮功能，結(jié)果說明直接移植誘導(dǎo)多能干細(xì)胞同樣能減輕心肌損傷，促進(jìn)心肌功能的好轉(zhuǎn)，未見明顯的免疫排斥反應(yīng)。以上研究都是通過干細(xì)胞心內(nèi)原位移植，模型動物需要接受開胸手術(shù)，較靜脈移植的損傷大。本研究結(jié)果表明人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可歸巢到心肌梗死邊緣區(qū)域，縮小了心肌梗死面積，改善了左室心肌功能。同時，本研究結(jié)果顯示，心肌功能和纖維化改善方面心肌細(xì)胞治療優(yōu)于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞治療，在血管再生方面人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞優(yōu)于心肌細(xì)胞。

研究發(fā)現(xiàn)，通過靜脈移植干細(xì)胞修復(fù)心肌損傷的過程中，干細(xì)胞不僅要經(jīng)血液定向遷移歸巢到心臟部位，還需要黏附于心肌組織內(nèi)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過變形運動穿過內(nèi)皮間隙直接與損傷心肌組織接觸〔27，28〕。CM-DiI熒光染料與細(xì)胞膜中的磷脂結(jié)合來標(biāo)記細(xì)胞，發(fā)出的紅色熒光強(qiáng)而穩(wěn)定，存在時間長〔29〕。結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞均歸巢到心肌梗死損傷部位，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞主要分布在梗死區(qū)域邊緣，心肌細(xì)胞則出現(xiàn)在損傷心肌組織內(nèi)；從數(shù)量上比較發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞歸巢數(shù)量高于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，其可能原因是心肌細(xì)胞與心肌組織的相容性優(yōu)于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，心肌細(xì)胞更容易定向遷移到心肌損傷部位發(fā)揮作用。Yu等〔30〕和Pinho-Ribeiro等〔31〕研究均證實經(jīng)靜脈移植間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死時僅有約2%的干細(xì)胞歸巢，最后只1%的干細(xì)胞定植。既往研究表明，干細(xì)胞移植治療心肌梗死的主要機(jī)制是通過旁分泌作用促進(jìn)血管新生和抑制心肌纖維化，而心肌細(xì)胞再生作用較小〔32～34〕。本研究提示人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可能通過旁分泌作用促進(jìn)組織中血管的再生；心肌細(xì)胞組血管再生情況與模型組沒有明顯差異的可能原因是心肌細(xì)胞不具有旁分泌功能。本研究提示人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可能通過抑制心肌纖維化減小心肌梗死面積。以上結(jié)果與趙啟明等〔35〕的薈萃研究一致，干細(xì)胞通過旁分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)血管新生和增加血管密度，改善損傷局部的微環(huán)境，抑制膠原纖維形成，改善心肌的組織結(jié)構(gòu)和提高心肌收縮能力。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。