TIM-3、STAT3、IL-6在結直腸腺癌中的表達及臨床意義

李福青 王紅 蔣海濤 杜勝奇 鐘江利

(遵義醫科大學附屬醫院消化內科，貴州 遵義 563003)

結直腸癌發病率及患病率呈逐年上升趨勢，且患者的發病率呈年輕化，給人類的生命健康帶來了極大的威脅，屬于危害生命健康的重大疾病。在我國，除肺癌和胃癌之外，結直腸癌的患病率居第3位，伴隨飲食結構、生活方式的不同，農村及城市中結直腸癌發病率也不一致，在城市惡性腫瘤中，結直腸癌發病率僅次于肺癌居第二位，在農村地區結直腸癌發病率低于胃癌、肺癌、食管癌、肝癌居第五位〔1，2〕。據相關統計，在全球范圍內每年新增加約120萬例結直腸癌患者，同時死亡人數每年高達60.9萬〔3〕，因此，探索結直腸腺癌的發生發展刻不容緩。白細胞介素(IL)-6、T細胞免疫球蛋白黏蛋白(TIM)-3、信號轉導和轉錄活化因子(STAT)3是目前在腫瘤發病機制中的研究重點，但在結直腸癌中的具體作用機制仍未明確。本實驗通過免疫組化檢測在正常結直腸黏膜組織、結直腸腺瘤組織及結直腸腺癌組織中TIM-3、STAT3、IL-6蛋白的表達及與臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2015～2018年在遵義醫科大學附屬醫院胃腸外科行結直腸癌根治術的70例結直腸腺癌患者蠟塊標本、42例結直腸腺瘤患者標本、10例正常結直腸黏膜標本(遵從健康人體檢自愿從腸鏡下取黏膜組織活檢患者)，所有標本有完整的病例資料、無放療、化療及惡性腫瘤史且行結直腸癌根治術并由病理科醫生診斷病理類型。70例結直腸癌標本中男37例、女33例；年齡：≥60歲36例、<60歲34例；部位：結腸32例、直腸38例；腫瘤大小：≥5 cm 41例、<5 cm 29例；浸潤深度：T1+T2 25例、T3+T4 45例；分化程度：高分化7例、中分化44例、低分化19例；淋巴結轉移：有淋巴結轉移48例、無淋巴結轉移22例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期22例、Ⅲ+Ⅳ期48例。

1.2主要試劑 兔抗人TIM-3多克隆抗體、兔抗人STAT3多克隆抗體及兔抗人IL-6多克隆抗體均購自美國Abcam公司；多聚-L-賴氨酸、磷酸鹽緩沖液(PBS)、檸檬酸鹽緩沖液、二氨基聯苯胺(DAB)顯色液等均購自上?；蚩萍加邢薰?；通用型山羊血清及其他試劑均由遵義醫學院附屬醫院消化內科實驗室提供。

1.3實驗方法 于遵義醫科大學附屬醫院病理科收集符合納入條件的蠟塊，將蠟塊3 μm連續切片，經二甲苯透明試劑Ⅰ、Ⅱ分別10 min脫蠟、濃度梯度100%、95%、80%、70%、50%乙醇分別5 min水化、3%過氧化氫10 min清除內源性過氧化物酶、檸檬酸鹽溶液(pH=6.0)抗原修復，冷卻后使用山羊血清封閉30 min，滴加一抗(兔抗人IL-6多克隆抗體1∶100，兔抗人TIM-3多克隆抗體1∶150，兔抗人STAT3多克隆抗體1∶200)過夜，第2天取出切片，復溫30 min，PBS沖洗3次，每次約10 min，加入適量二抗(兔鼠通用型)30 min，PBS沖洗3次，每次約10 min，DAB顯色(顯色劑A 1 000 μl：顯色劑B 40 μl)，蘇木素復染4 min，流水沖洗3 min，鹽酸酒精分化10 s，流水沖洗10 min，然后放入濃度梯度50%、70%、85%、95%、100%乙醇中，每次2 min進行脫水，切片風干后蓋片顯微鏡下讀取結果。

1.4實驗結果判定 首先在100倍物鏡下觀察標本，排除非特異性染色的區域后，找到陽性細胞著色最強的位置，將物鏡調整到400倍，在5個有表達性強的視野下，分別計數細胞的著色強弱(無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分)及陽性細胞百分率為陽性細胞數占總細胞數的比值(0分<5%，1分 6%～25%，2分 26%～50%，3分 51%～75%，4分>75%)，兩者相乘為0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強陽性。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、Spearman相關性分析。

2 結 果

2.1各組TIM-3、STAT3、IL-6陽性率比較 TIM-3、 STAT3、IL-6陽性表達主要集中在細胞質，呈黃色、黃棕色或棕色顆粒，在正常結直腸黏膜、結直腸腺瘤及結直腸腺癌組織中TIM-3、STAT3、IL-6均有表達。TIM-3、STAT3、IL-6陽性率比較：結直腸腺癌組>結直腸腺瘤組>正常結直腸黏膜組(均P<0.05)。見表1，圖1。

圖1 各組TIM-3、STAT3、IL-6表達情況(DAB,×400)

表1 各組TIM-3、STAT3、IL-6陽性率比較〔n(%)〕

2.2TIM-3、STAT3、IL-6與結直腸腺癌患者臨床病理特征之間的關系 結直腸腺癌組織TIM-3蛋白的表達情況與腫瘤直徑、患者年齡、性別以及腫瘤生長部位均無關(P>0.05)，但與腫瘤的TNM分期、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度和腫瘤的分化程度均相關(P<0.05)，TNMⅢ+Ⅳ期陽性表達率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，有淋巴結轉移的陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移(χ2=10.329，P<0.05)；腫瘤浸潤深度T1+T2陽性表達率明顯低于T3+T4組(χ2=4.432，P<0.05)；低分化陽性率明顯高于中分化及高分化(χ2=7.638，P<0.05)。STAT3蛋白的表達與腫瘤大小、患者年齡、性別、浸潤深度、分化程度及腫瘤生長部位均無關(P>0.05)，但與腫瘤的臨床分期、有無淋巴結轉移相關(P<0.05)，TNM Ⅲ+Ⅳ期陽性率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(χ2=12.992，P<0.05)；有淋巴結轉移的陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移(χ2=8.767，P<0.05)。IL-6蛋白的表達與腫瘤大小、患者年齡、性別及腫瘤生長部位均無關(P>0.05)，但與腫瘤的臨床分期、有無淋巴結轉移、腫瘤浸潤深度和腫瘤的分化程度均相關(P<0.05)，TNM Ⅲ+Ⅳ期陽性表達率明顯高于Ⅰ+Ⅱ期(χ2=17.60，P<0.05)；有淋巴結轉移的陽性表達率明顯高于無淋巴結轉移(χ2=8.839，P<0.05)；腫瘤浸潤深度T1+T2陽性表達率明顯低于T3+T4組(χ2=4.432，P<0.05)；低分化陽性表達率明顯高于中分化及高分化(χ2=12.454，P<0.05)。見表2。

表2 TIM-3、STAT3、IL-6蛋白表達與結直腸腺癌患者臨床病理特征之間的關系〔n(%)〕

2.3TIM-3、STAT3、IL-6在結直腸腺癌中表達的相關性 有54例結直腸腺癌標本STAT3和IL-6均陽性，10例IL-6陽性而STAT3陰性，2例STAT3陽性而IL-6陰性。4例IL-6和STAT3均陰性，Spearman相關性分析可知，TIM-3蛋白與STAT3蛋白的表達呈正相關(r=0.357P=0.002)。

3 討 論

TIM基因家族編碼的I膜蛋白即為TIM-3，位于染色體5q33.2〔4〕。在腫瘤微環境中，持續高表達的TIM-3分子的糖基化側鏈與其配體半乳凝素9結合后，一方面能促進髓源抑制細胞(CD11b+Gr-1+MDSC和CD4+FoXP3+Treg)的增殖，另一方面特異性地降低轉錄因子T細胞中表達的T盒即TIM-3和BAT-3結合后導致細胞內片段分離，并將抑制信號傳遞到細胞內片段，削弱T淋巴細胞的增殖，加速其衰竭并凋亡，從而抑制T細胞介導的免疫應答〔5～7〕。然而在結直腸癌中TIM-3分子遠端的N-黏性末端可通過與癌胚抗原相關細胞黏附分子(CEACAM)1順式或反式結合，導致TIM-3與Bat3的結合，從而上調TIM-3表達，削弱了T細胞的免疫反應，從而促進腫瘤細胞增殖〔8〕。Huang等〔9〕通過小鼠直腸癌模型實驗證實CEAAM1TIM-3細胞的比例遠高于CD4T細胞。同時，CEACAM1可通過調節TIMP-3的表達而誘導T細胞免疫耐受，從而削弱結直腸腺癌患者免疫系統的抗腫瘤能力。在腫瘤患者免疫系統中固有免疫是第一道防線，Chiba等〔10〕研究發現，結直腸腺癌患者的浸潤性樹突細胞(DC)TIM-3的持續高表達，它與核酸競爭與高遷移率蛋白(HMG)B1結構域A盒競爭，阻礙核酸與HMGB1的結合，因此抗原抗體復合物不能通過Toll樣受體(TLR)識別，導致IL受體相關激酶P將被阻斷，從而破壞HMGB1介導核酸進入細胞的固有免疫，導致腫瘤細胞凋亡后由核酸釋放的免疫原性降低，抑制核酸介導的先天性抗腫瘤免疫反應。同時持續高表達的TIM-3還可通過促使巨噬細胞M2型極化，抑制M1型極化，減弱巨噬細胞吞噬和殺傷效應抑制大腸癌患者腫瘤細胞發生免疫應答，造成大腸癌腫瘤細胞發生免疫逃逸〔11〕。Wang等〔12〕研究發現，通過阻斷TIM-3能提高機體固有免疫，從而在一定程度上增加機體的抗腫瘤能力。本實驗提示在結直腸腺癌患者中TIM-3持續表達可能存在促進腫瘤發生發展或致癌的作用，且腫瘤的浸潤程度越深、分化程度越差、分期越高伴淋巴結轉移的結直腸腺癌患者，TIM-3的表達陽性率越高。

STAT是一種細胞質轉錄因子，由生長因子和細胞因子等肽類配體激活〔13〕。STAT3是STAT家族中的一員，STAT3在白血病、前列腺癌、多發性骨髓瘤、結直腸癌、乳腺癌、肝癌等實體腫瘤及血液組織中持續表達。張國強等〔14〕通過免疫組化實驗證明持續高表達的STAT3基因參與結直腸癌的發生與發展，并且與淋巴結轉移、分期相關。c-myc基因和細胞周期蛋白(cyclin)D1通過SH2結構域和Src表達上調，抑制結直腸癌細胞凋亡并促進其增殖，促進結腸癌的發生和發展〔15～19〕。研究表明，IL-6作為STAT3的活化因子，通過與配體GP130特異性結合，激活JAK激酶同時磷酸化STAT3，促使JAK2/STAT3信號通路被激活，促進結直腸腺癌細胞的增長〔20〕。同時JAK2/STAT3信號通路也可通過生長因子(VEGF)促進腫瘤新生血管生成，導致腫瘤細胞轉移。此外STAT3不僅可直接調控VEGF，也可通過HIF-1α的表達間接促進VEGF，進而促進結直腸癌增殖。

IL-6主要由單核細胞、成纖維細胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞及多種腫瘤細胞產生，其包括了184個氨基酸，擁有一段疏水信號(其包含28個氨基酸)及兩個含有潛在糖基化部分的N端，此外IL-6還擁有C端第4氨基酸鄰近區域及N端31-31氨基酸區域的兩個活動中心〔21〕。IL-6主要作用為誘導T、B細胞的分化及作用和促進造血功能等，但IL-6亦可抑制免疫系統，刺激腫瘤細胞新生血管的形成，參與了腫瘤的發生與發展。IL-6促使腫瘤發生發展的方式最主要為激活STAT3表達，其通過經典途徑即IL-6R直接與配體gp130特異性結合和跨信號轉導途徑即IL-6在不通過IL-6R與gp130特異性結合的情況下，直接與sIL-6R結合，形成sIL-6R/IL-6復合物，刺激細胞膜上gp130形成同源二聚體，激活JAK激酶同時磷酸化STAT3，促使JAK2/STAT3信號通路被激活，表達和轉錄靶基因，促進結直腸腺癌細胞的增長及新生血管形成，削弱腺癌細胞的凋亡〔22～24〕。張曉芹等〔25〕通過免疫組化表明，結直腸癌細胞中STAT3的表達與IL-6的表達上調，并且呈正相關。