抗交叉反應性糖類決定簇抗體吸附劑在過敏原體外檢測中的應用價值

王燕 朱澤華 汪明星 貴志芳 劉玉華 張臘紅

目前過敏性疾病已越來越普遍，它可發生在各個 年齡階段，以老人和兒童發病率稍高。據世界變態反應組織（WAO）統計，近30年間過敏性疾病的發生率至少增加了3倍，目前全球總患病率已達30%，過敏已成全球第六大疾病[1-2]。在我國，過敏性疾病發病率也呈逐年遞增的趨勢，已成為嚴重影響我國人群健康的常見疾病之一[3]。

過敏性疾病是由變應原引發人體變態反應而導致的一類疾病，常累及呼吸系統、消化系統和皮膚等，臨床表現形式多樣，常見皮膚濕疹、過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性腸炎、蕁麻疹以及結膜炎等，其診治有賴于過敏原的確定。目前常規確診方法是檢測血清變應原特異性IgE（specific IgE,sIgE）。然而通常使用的免疫印跡法檢測sIgE結果易出現假陽性，導致檢測結果與臨床診斷不相符合[4-5]。目前公認的交叉反應性糖類決定簇（cross-reactive carbohydrate determinants,CCD）是一個可引起非特異性陽性結果的潛在干擾源，從而出現假陽性[6-7]，部分廠家在檢測試劑條中添加了CCD指示帶，提示CCD陽性引起的干擾，但是如何排除此干擾尚未定論。本研究采用抗CCD抗體吸附劑處理CCD指示帶陽性和陰性的過敏原sIgE陽性患者樣本，旨在排除CCD引起的干擾，同時觀察吸附劑處理后對過敏原真陽性結果是否有影響，使實驗室結果更準確，指導臨床醫生進行更有針對性的治療。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2018年12月至2019年9月杭州師范大學附屬醫院經過敏原檢測的92例sIgE陽性患者的靜脈血樣本，其中CCD指示帶陽性62例（CCD陽性組），陰性30例（CCD陰性組）。CCD陽性組男39例（62.9%），女 23例（37.1%），年齡 4～88（43.87±17.12）歲；CCD陰性組男 18例（60.0%），女12例（40.0%），年齡 2～87（40.60±27.80）歲。兩組患者性別、年齡的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院醫學倫理委員會批準。

1.2 試劑和儀器 過敏原檢測試劑及抗CCD抗體吸附劑由德國歐蒙公司提供，具體為特異性變態反應原檢測試劑盒（試劑批號：A181128AO）；抗CCD抗體吸附劑（試劑批號：A190723AF）。儀器為德國歐蒙公司EUROBLOTMaster（Ⅱ）免疫印跡法自動操作儀、EURO Line Camera掃描儀掃描和EUROLineScan3.4.25判讀系統。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 使用內含促凝劑的快速血清管，采集進行過敏原檢測的患者空腹外周靜脈血3～4 ml，室溫靜置30 min，3 500 r/min離心5 min用于本項目檢測。

1.3.2 抗CCD抗體吸附劑復溶 將1支抗CCD抗體吸附劑（凍干粉）溶于110 μl蒸餾水，室溫放置20 min后，再用漩渦混勻器充分混勻30 s，17 000 r/min離心30 s并收集復溶液；溫育：按吸附劑與血清1∶20的比例將抗CCD抗體吸附劑加入待測樣本中，搖床上室溫25℃溫育1 h。

1.3.3 CCD被吸附后樣本的檢測 抗CCD抗體吸附劑處理前后的樣本采用免疫印跡法檢測血清樣本中的CCD IgE及sIgE的表達情況，具體按照試劑盒說明書操作。CCD IgE及19種特異性過敏原均采用分級報告，具體為：兩組膜條用EURO Line Camera掃描儀收集數據后，EUROLineScan 3.4.25判讀軟件對結果進行比對，根據條帶著色強度自動判讀結果，分0～6級，著色越深級別越高，表示抗體水平越高。過敏原的檢測膜條共包括20種成分，分別為：CCD、10種吸入性過敏原（樹木組合、豚草、艾蒿、塵螨、屋塵、貓毛、狗上皮、蟑螂、霉菌組合、葎草）、9種食入性過敏原（雞蛋白、牛奶、花生、黃豆、牛肉、羊肉、海洋魚類組合、蝦、蟹）。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料以百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者經CCD抗體吸附劑處理后CCD指示帶的變化情況 CCD陽性組經抗CCD抗體吸附劑處理后61例轉陰，轉陰比例為98.4%（61/62），級別下降1例，通過加大吸附劑的濃度后也轉陰；CCD陰性組經處理后檢測結果無變化，見表1。

表1 兩組患者經CCD抗體吸附劑處理后CCD指示帶的變化情況

2.2 92例樣本陽性條帶個數在吸附劑處理前后的變化情況 CCD陽性組樣本在吸附劑處理前有60例樣本的陽性條帶數集中分布在5～11條，經CCD吸附劑處理后減為0～6條；1例樣本陽性條帶數由1條減為0條；另外有1例樣本陽性條帶數由18條減為17條，此樣本條帶數變化雖不明顯，但相應級別均下降。CCD陰性組陽性條帶數集中分布在1～4條，在吸附劑處理后不受影響，見圖 1、2。

圖1 抗交叉反應性糖類決定簇（CCD）抗體吸附劑處理前后CCD陽性組陽性條帶數的變化

2.3 CCD陽性組sIgE經吸附劑處理后其它特異性陽性條帶的變化情況 抗CCD抗體吸附前，62例CCD陽性組中sIgE陽性條帶總數為499條，吸附后陽性條帶總數為116條，下降了76.8%。處理后各過敏原檢測條帶轉陰比例由高到低分別為：花生（95.0%）、葎草（94.9%）、樹木組合（91.8%）、艾蒿（91.7%）、豚草（91.7%）、黃豆（87.0%）、蟑螂（66.0%）和蟹（61.7%），且與吸附劑處理前后差異均有統計學意義（均P＜0.01）。其它過敏原在吸附劑處理前后差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 CCD陽性組sIgE陽性條帶在吸附劑處理前后的變化情況

2.4 CCD陽性組sIgE在吸附劑處理前后檢測值的變化情況 CCD陽性組血清經抗CCD抗體吸附劑處理后吸入性過敏原sIgE中的樹木組合、豚草、艾蒿、蟑螂和葎草與食入性過敏原sIgE中的花生、黃豆和蟹的檢測值明顯減低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而其他過敏原sIgE值在吸附劑處理前后差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見圖3。

圖2 抗交叉反應性糖類決定簇（CCD）抗體吸附劑處理前后CCD陰性組陽性條帶數的變化

圖3 交叉反應性糖類決定簇（CCD）抑制劑處理前后各特異性IgE（sIgE）的變化（與處理前比較，*P＜0.05）

3 討論

隨著社會的發展，人們生活飲食習慣的改變，新生的、合成的、轉基因的產物層出不窮，過敏性疾病的發病率逐年增加，已成為嚴重影響人群健康的常見疾病之一[3]。患者就診時，醫生通過分析患者臨床資料結合實驗室血清學變應原sIgE檢測是目前Ⅰ型變態反應病診斷的主要依據。然而，血清變應原sIgE檢測結果與臨床診斷結果常存在差異，特別是血清中存在CCD導致的交叉反應是造成兩者不符合的重要原因之一[8]。

CCD是一類廣泛存在于動植物糖蛋白中的糖類基團[9]，其結構保守，不同物種來源的過敏原（昆蟲、貝類、植物花粉、水果和乳膠等）中CCD存在相似性，可誘導人體產生與多種變應原發生交叉反應的抗CCD特異性IgE（anti-CCD IgE）。由于anti-CCD IgE的存在，檢測結果中不能區分是由抗過敏原蛋白表位IgE抗體引起的陽性反應，還是anti-CCD IgE引起的交叉反應造成的假陽性結果。一般anti-CCD IgE不引起變態反應癥狀，沒有臨床意義[10]，但其免疫原性對過敏原體外檢測結果的干擾作用卻不容忽視。有文獻報道約15%～30%的過敏患者能夠檢測到anti-CCD IgE抗體，且出現多種條帶陽性，這就給臨床鑒定特異性過敏原帶來了一定的困難[11]。

使用CCD吸附劑可有效降低特異性過敏原假陽性的發生，據報道一些研究機構應用不同的吸附劑，如加入辣根過氧化物酶（HRP）、菠蘿蛋白酶糖基肽（MUXF）和含CCD的油菜花粉等去除CCD干擾引起假陽性的檢測中[12-16]，但尚未有公認的解決方案。本研究直接使用抗CCD抗體吸附劑處理樣本，通過對比處理前后的結果發現，62例CCD陽性指示帶樣本經抗CCD抗體吸附劑處理后有61例CCD陽性指示帶轉陰，轉陰比例為98.4%，還有1例級別下降，通過加大吸附劑的濃度后也轉陰。CCD陽性組陽性條帶數在吸附后明顯下降，而CCD陰性組無變化，說明抗CCD抗體吸附劑能抑制anti-CCD IgE對過敏原陽性結果的干擾，而對真陽性樣本不產生影響。本研究發現CCD陽性組樣本陽性條帶數集中分布在5～11條，CCD陰性組樣本陽性條帶數集中分布在1～4條，說明多種變應原陽性時，anti-CCD IgE對sIgE檢測干擾的可能性就越大，這與莫燕芳等[17]的研究結果一致。因此當有多項sIgE陽性時，提示可能會有anti-CCD IgE的干擾，在臨床診斷過敏性疾病過程中應充分考慮anti-CCD IgE的影響。

經CCD抗體吸附劑處理后各過敏原檢測條帶轉陰比例由高到低分別為花生、葎草、樹木組合、豚草、艾蒿、黃豆、蟑螂和蟹，且檢測值明顯降低，說明其易受anti-CCD IgE的干擾。另在本次研究中有30例塵螨sIgE陽性的樣本，經CCD吸附劑處理后仍有27例樣本的塵螨sIgE陽性，說明塵螨sIgE不易受CCD吸附劑的影響，其他過敏原由于陽性樣本例數過少，差異無統計學意義。

綜上所述，對過敏性疾病首先應盡快明確其過敏原，目前結合臨床癥狀和血清sIgE的檢測是臨床診斷過敏性疾病的主要手段，在遇到多項變應原檢測結果同時陽性或與臨床癥狀不符時，更要提高警惕，應將anti-CCD IgE考慮其中，若CCD指示帶陽性，可再補充抗CCD抗體吸附劑預處理實驗，以消除anti-CCD IgE引起的交叉反應對結果的干擾，提升檢測結果的準確性。

對于上述易受CCD干擾的過敏原種類，在后期研究中筆者將進一步分析這些過敏原是否存在類似的分子結構與生物特征，探討其與CCD的關聯性。此外，隨著DNA技術的發展和應用，變應原分子診斷（molecular-based allergy,MA）不斷被識別克隆，后期可將MA技術引入過敏性的研究中，通過分子水平上的精確定位識別患者真正的致敏組分和引起交叉反應的變應原組分，以建立準確評估過敏原檢測的分析系統，幫助醫生對患者進行正確的過敏風險評估及有效和優化的治療。