血清分泌型絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型對浸潤性肺腺癌的診斷價值

林帥東 續力云 陸暢暢 石邈 黃燕燕 樂涵波

分泌型絲氨酸蛋白酶型抑制劑Kazal 1（serine protease inhibitor kazal type 1,SPINK1）是一種大小為6.2 KDa的絲氨酸蛋白酶分泌抑制劑，最初分離于卵巢癌患者尿液，又名腫瘤相關組織抑制劑（tumor associated tissue inhibitor,TATI）[1]。此后，SPINK1 被發現過表達于多種腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等[2-3]。SPINK1的結構與表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）相似，可通過激活EGFR/MAPK信號通路刺激腫瘤細胞增殖從而影響腫瘤進展，還可促進上皮-間充質轉換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）參與腫瘤轉移[4-8]。

目前有多項研究對血清、腫瘤組織以及尿液進行了分析，發現了SPINK1作為生物標志物的潛在價值[3]。然而，SPINK1在肺腺癌患者血液中的表達情況如何尚不清楚。因此，筆者通過測定肺腺癌患者血清SPINK1濃度，分析其與癌組織SPINK1蛋白表達水平的相關性以及其與臨床病理特征之間的關系，探討其作為血清標志物對浸潤性肺腺癌的潛在診斷價值，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2014年1月至2019年12月在浙江大學舟山醫院接受肺葉切除手術或肺楔形切除手術的153例肺腺癌患者的術前血液樣本及手術標本，患者男55例，女98例，平均年齡56.2歲；其中原位腺癌38例，微浸潤性腺癌39例，浸潤性肺腺癌76例。選擇同期本院健康志愿者28例血液樣本，志愿者男10例，女18例，平均年齡55.7歲。兩組受試者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院醫學倫理委員會批準，所有對象均知情同意。

1.2 方法 兩組受試者均采集清晨空腹血2 ml。采血后立即離心，分離血清，保存于-80°C冰箱備用。

1.3 血清SPINK1濃度的檢測 采用ELISA法。按ELISA試劑盒（Human SPINK1 Duoset,R＆D system,USA）說明書操作。將所有稀釋的樣品和標準品加入孔中，室溫下孵育2 h，棄上清液，用洗滌緩沖液洗小孔3次，洗滌完畢后加入已稀釋的SPINK1抗體，室溫孵育2 h。再次用洗滌緩沖液洗3次，每孔加入100 μl稀釋的辣根過氧化物酶，室溫孵育20 min。用洗滌緩沖液洗3次后每孔中加入100 μl底物，室溫避光孵育20 min，加反應終止液終止反應，上機檢測450 nm處吸光度，根據標準曲線公式計算每個小孔中的SPINK1濃度。所有檢測的血清樣本以及標準樣本和空白對照均重復檢測3次。

1.4 肺腺癌患者癌組織及癌旁組織中SPINK1 mRNA的檢測 采用熒光定量PCR法。將肺組織放入研磨器中，按照重量體積1∶9的比例加入1×PBS緩沖液，充分研磨后按4℃、3 000r/min、15 min離心，棄上清液，加入1 ml Trizol液并充分混勻后提取RNA。以提取的RNA為模板進行反轉錄，產物即cDNA，放于-20℃備用。采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Applied Biosystems）進行 qRT-PCR，并在 ABI 7500（Thermo，Waltham，MA） 按以下條件下運行：95 ℃10 min，然后在95℃ 15 s變性，60℃ 1 min退火，72℃ 15延伸的40個循環中運行。末次循環后行熔解曲線檢測反應產物單一性。SPINK1引物序列如下，上游引物：5'-ATATGACCCTGTCTGTGGGAC-3'，下游引物：5'-CAGCAAGGCCCAGATTTTTGA-3'，擴增的基因片段長度為114 bp。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCT法計算SPINK1 mRNA的表達水平。

1.5 肺腺癌患者癌組織及癌旁組織SPINK1蛋白表達檢測 采用免疫組織化學染色法。每個手術切除的組織樣本經多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋，連續切取4個4 μm厚切片。經如下步驟：脫蠟、封閉、抗原修復，滴加小鼠抗人SPINK1單克隆抗體（Abcam）、沖洗、滴加生物素二抗、沖洗、顯色。在染色過程中，以磷酸鹽緩沖液代替原代抗體的切片作為陰性對照。由2位病理科副主任醫師評價免疫反應染色強度（stainingintensity,si）和陽性細胞百分比（positivepercent,pp），并對染色結果進行評分。si評分：0分為未見陽性細胞，1分為細胞陽性染色最強處呈現弱陽性，2分為陽性，3分為可見強陽性染色的細胞。pp評分：0分為無染色陽性區域，1分為陽性染色區域≤10%，2分為陽性染色區域11%～50%，3分為陽性染色區域51%～80%，4分為陽性染色區域＞80%。免疫組化染色得分=si分值×pp分值。最后按照得分分為高表達組（7～12分）與低表達組（0～6分）。

1.6 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。血清SPINK1濃度與癌組織SPINK1 mRNA表達水平的關系分析采用Pearson相關；浸潤性肺腺癌的預測因素分析采用單因素及多因素logistic回歸；通過繪制血清SPINK1以及癌胚抗原（CEA）的ROC曲線，評價血清SPINK1對浸潤性肺腺癌的診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺腺癌患者與健康志愿者血清SPINK1濃度的比較 浸潤性肺腺癌患者血清SPINK1濃度為（1 868±105.5）pg/ml明顯高于健康志愿者的（842.0±70.36）pg/ml、原位腺癌的（966.2±75.18）pg/ml、微浸潤性腺癌的（1 076±60.40）pg/ml，差異均有統計學意義（均 P＜0.01）；而原位腺癌、微浸潤性腺癌患者與健康志愿者間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

2.2 血清SPINK1濃度與肺腺癌組織SPINK1 mRNA水平的相關性分析 血清SPINK1濃度與癌組織SPINK1 mRNA表達水平呈正相關（r=0.277，P=0.014），見圖1。以肺腺癌患者血清SPINK1濃度的平均值1 419 pg/ml為臨界值，分為血清SPINK1高濃度組71例和低濃度組82例，對比兩組患者癌組織SPINK1蛋白表達水平，結果發現，血清SPINK1低濃度組在SPINK1蛋白低表達組中上占29%，高濃度組在SPINK1蛋白低表達組中上占17%，血清SPINK1低濃度組在SPINK1蛋白高表達組中上占13%，高濃度組在SPINK1蛋白高表達組中上占41%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。典型患者肺腺癌組織和相應癌旁組織SPINK1蛋白表達見圖3。

圖1 血清分泌型絲氨酸蛋白酶型抑制劑Kazal 1（SPINK1）濃度與癌組織SPINK1 mRNA表達水平的散點圖

圖2 血清分泌型絲氨酸蛋白酶型抑制劑Kazal 1（SPINK1）高濃度組與低濃度組患者癌組織SPINK1蛋白表達水平比較

圖3 典型患者免疫組織化學染色病理檢查圖（a：肺腺癌組織；b：相應癌旁組織；×200）

2.3 肺腺癌患者血清SPINK1濃度與臨床病理特征的關系 高濃度組與低濃度組患者在性別、年齡、吸煙史、淋巴結轉移和胸膜侵犯間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），而在病理類型、腫瘤大小以及 TNM分期間比較差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 肺腺癌患者血清SPINK1濃度與臨床病理特征的關系[例（%）]

2.4 浸潤性肺腺癌預測因素分析 單因素分析發現，血清SPINK1濃度、CEA和腫瘤大小與浸潤性肺腺癌發生的風險有關。進一步多因素分析顯示，血清SPINK1濃度、CEA和腫瘤大小是浸潤性肺腺癌的獨立預測因素。見表3。

表3 浸潤性肺腺癌預測因素分析

2.5 血清SPINK1濃度、CEA對浸潤性肺腺癌的診斷價值 血清SPINK1濃度診斷的AUC為0.83，最佳截斷值為1 288.5729 pg/ml，靈敏度為0.743，特異度為0.827。而CEA診斷的AUC為0.73，最佳截斷值為1.975pg/ml，靈敏度為0.586，特異度為0.800。見圖4。

圖4 血清分泌型絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1（SPINK1）濃度和癌胚抗原（CEA）診斷浸潤性肺腺癌的ROC曲線（a：血清SPINK1濃度；b：CEA）

3 討論

研究發現SPINK1的氨基酸序列與表皮生長因子（EGF）相似[9]。因此，SPINK1被認為可能是一種自分泌或旁分泌生長因子。有研究證實，SPINK1在多種惡性腫瘤血液中可被檢測到，但在肺腺癌血液中的研究還鮮有報道[10-11]。本研究前期發現，SPINK1在肺癌組織高表達并與預后相關，在此基礎上進一步探討了肺腺癌血清SPINK1濃度及其在組織中表達水平的關系以及與臨床病理特征的關系，以及其作為浸潤性肺腺癌診斷的潛在標志物的可行性。

已有研究發現，大多數胰腺癌患者SPINK1血清濃度明顯升高[10]。另一項研究也發現，肝癌患者血漿SPINK1濃度亦顯著升高[11]。在50%的結直腸癌患者中亦觀察到血清SPINK1濃度升高并且與預后相關[12]。本研究發現，與健康志愿者相比，肺腺癌患者血清SPINK1表達上調，與目前的研究結果相一致。前期研究發現，與癌旁組織相比，肺腺癌組織SPINK1表達上調。在此基礎上，筆者進一步分析了血清SPINK1濃度與癌組織SPINK1表達水平的相關性，結果發現血清SPINK1濃度與癌組織SPINK1 mRNA表達水平呈正相關，與癌組織SPINK1蛋白表達水平亦呈正相關，提示血清SPINK1濃度隨著癌組織SPINK1表達水平變化而變化，提示血清濃度可反映癌組織SPINK1表達水平，具有作為血清診斷標志物的潛力。

本研究進一步分析了肺腺癌患者血清SPINK1濃度與臨床病理特征的關系，結果發現，高濃度組與低濃度組患者在不同病理類型、腫瘤大小以及TNM分期比較差異均有統計學意義。本研究發現，與原位腺癌與微浸性肺腺癌組相比，浸潤性肺腺癌相血清SPINK1高濃度者占比較高。2011年公布的肺腺癌新分類標準中指出，原位腺癌與微浸性肺腺癌，這兩類患者若接受根治性手術，則其疾病特異性生存率分別為100%或接近100%，而浸潤性肺腺癌生存率相對較低。因此，原位腺癌與微浸潤腺癌被認為是早期腺癌階段，而浸潤性肺腺癌惡性程度較高。筆者發現，與腫瘤大小≤1 cm組相比，＞1 cm組肺腺癌血清SPINK1高濃度者占比較高；與TisN0M0～Ⅰ組相比，Ⅱ～Ⅳ分期組血清SPINK1高表達者占比亦較高。以上結果提示，血清SPINK1可能是惡性程度較高肺腺癌診斷的標志物。筆者進一步探討了SPINK1對浸潤性肺腺癌的診斷效能，結果顯示，AUC可達0.83，靈敏度為0.743，特異度為0.827，表明血清SPINK1對浸潤性肺腺癌具有良好的診斷效能。因此，本研究認為血清SPINK1可作為浸潤性肺腺癌的血清生物標志物。然而，血清SPINK1的確切來源，具體是由哪些類型的細胞分泌而來的尚無直接證據。現有研究報道以及本研究結果提示，血清SPINK1可能是部分腫瘤細胞分泌而來。然而，發表于Nature Communication的一項研究證實，腫瘤微環境基質細胞能夠分泌SPINK1[13]。因此，筆者推測部分血清SPINK1是由腫瘤基質細胞分泌的。分泌的SPINK1在肺腺癌發生、發展中的作用，目前尚不清楚，有待進一步研究。

本研究尚有不足之處。首先，納入的肺腺癌患者尚無5年生存數據，因此，不能分析血清SPINK1與患者預后關系。其次，樣本例數相對較少，需要進一步擴大樣本量。本研究探索的SPINK1作為浸潤性肺腺癌患者血清診斷標志物的可行性，將為肺腺癌的診斷提供新的靶點。