利用15N2直接標記法研究水稻種植對稻田固氮量和固氮活性的影響①

張燕輝，胡天龍，王 慧，靳海洋，劉本娟，劉紅濤，劉 琦，林志斌，藺興武，謝祖彬

利用15N2直接標記法研究水稻種植對稻田固氮量和固氮活性的影響①

張燕輝1,2，胡天龍1,2，王 慧1,2，靳海洋1,2，劉本娟1,2，劉紅濤1,2，劉 琦3，林志斌1,2，藺興武1,2，謝祖彬1*

(1土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008；2中國科學院大學，北京 100049；3南京林業大學林學院，南京 210008)

稻田固氮對土壤維持肥力有著重要的作用，但水稻種植與固氮菌及其活性之間的關系尚不清楚。本試驗利用15N2直接標記法測定了下位砂姜土發育的簡育水耕人為土在種水稻和不種水稻條件下的生物固氮量，及其在土壤不同層次(0 ～ 1、1 ～ 5、5 ～ 15 cm)和水稻中的分配，并通過實時熒光定量PCR技術測定了土壤中固氮菌DNA及RNA基因數量。結果表明：種水稻處理顯著提高了土壤各層固氮量，尤其提高了1 ～ 5 cm和5 ～ 15 cm土層土壤固氮量對總固氮量的貢獻；種水稻處理的總固氮量是不種水稻處理的10.3倍；水稻植株中生物固定的氮占總固氮量的31.48%；在0 ～ 1 cm土層，種水稻處理顯著提高了RNA基因數量，而對DNA基因數量的增加不顯著?？梢?，水稻種植沒有增加固氮菌的數量，稻田固氮量的增加是因為水稻種植極大地促進了固氮菌基因的表達，提高了固氮菌的固氮活性。

生物固氮；固氮活性；稻田；15N2直接標記法；反轉錄

水稻是人類所需的三大主要糧食作物之一，據估計，水稻養活了全世界50% 、亞洲85% 的人口[1]。隨著全世界人口不斷增長，糧食產量也需要進一步提高。水稻產量的提升受到稻田土壤缺氮的限制，為補充農田中的氮素，大量的化學氮肥被施入，導致了高浪費和嚴重的環境污染[2]。而固氮微生物自身固定的氮素能被植物有效利用，且不產生環境污染問題。自身固氮也是許多生態系統氮的主要輸入途徑，維持著全球植物的生產力[3]。在Haber-Bosch 發明工業合成氮肥以前，水稻田中的氮素來源主要是生物固氮，所以生物固定的氮被認為是谷物生產中潛在且有吸引力的替代氮源[4]。

種植水稻甚至種植不同品種的水稻均會改變稻田土壤微生物生長環境，從而改變稻田微生物群落結構。固氮菌作為稻田中廣泛存在的細菌，其群落結構及其固氮能力也會受到種植水稻的影響[5-6]。如Yoshida和Ancajas[7]通過乙炔還原法研究發現，無論是在雨季還是旱季，無論淹水還是干旱稻田，整個生長季種水稻處理比不種水稻處理生物固氮量均高出2倍左右。Bei等[8]通過15N2直接標記法研究發現，培養70 d種水稻處理15N固定量均高于不種水稻處理。不同水稻品種也會影響稻田生物固氮，研究發現雜交稻品種(IIY)比自交稻品種(W23)對稻田生物固氮促進作用更大[9-10]。Ito等[11]用兩種水稻品種進行水培，發現其固氮活性相差近1倍。可見，水稻種植與否及其品種對稻田固氮量有很大影響，因此在估算稻田固氮潛力時，必須要考慮水稻種植情況及其品種。而在1年時間內，撂荒和水稻生長季稻田土壤對生物固氮量的貢獻分別是多少，目前還不清楚。

固氮量由活躍固氮微生物的數量以及固氮活性決定。編碼固氮酶鐵蛋白亞基的基因通常被用來研究固氮微生物和評估固氮潛力[12]。前期研究大多數基于DNA基因進行分析，這些研究提供了固氮微生物潛在固氮活性的很多有價值的信息[13-15]。但是研究發現，基因拷貝數與固氮活性并沒有顯著的相關性[16-17]。固氮菌基因拷貝數僅能代表土壤中固氮菌的數量，不能直接說明其參與了固氮過程。而從土壤中直接提取RNA，再反轉錄成cDNA，然后對cDNA的基因進行定量擴增，得出轉錄拷貝數被認為更能代表固氮微生物活性[15,18]。

研究稻田生物固氮，首先要對稻田固氮量進行測定。目前在水稻土壤中測定固氮量常用的方法有：乙炔還原法[19-20]、15N2自然豐度法[21]、15N2同位素稀釋法[20]、氮素平衡法[22]等非直接的測定方法，這些方法由于缺少準確的轉換因子，或者要考慮氮源、氮損失等各種因素而存在很大的不確定性。測定固氮量最直接的方法是15N2氣體標記法，該方法不需要轉換系數，不受外來氮源干擾，從而能夠準確測定固氮量[23-24]。該方法難點在于要長時間保持系統密閉性，且為了反映田間水稻生長的真實環境，需要實現標記箱內CO2濃度、O2濃度、溫度和光照條件等環境與大田環境相似；另外，高純度高豐度15N2氣體價格十分昂貴，這些都限制了該方法在自然環境條件下的廣泛應用[25]。

本試驗利用15N2標記密閉生長箱系統[8]，在田間環境下，自插秧后進行15N2直接標記整個生長季，測定下位砂姜土在種水稻和不種水稻情況下的生物固氮量，并對土壤DNA 和cDNA的基因進行實時熒光定量PCR擴增，測定固氮菌數量以及固氮酶基因表達量，從而計算其固氮活性。

1 材料與方法

1.1 試驗地描述和土壤理化性質

試驗地位于江蘇省揚州市小紀鎮馬凌村良種場(32°35′5″ N，119°42′0″ E)，該地區氣候條件為典型亞熱帶季風氣候，年降水量1 000 mm左右，年蒸發量大于1 100 mm，年均氣溫15 ℃，年日照時間大于2 000 h，年無霜220 d。試驗地種植模式為稻麥輪作，土壤類型為下位砂姜土發育的簡育水耕人為土[26]。2017年水稻季后，隨機取試驗地耕作層(0 ～ 15 cm)土壤，風干過4 mm篩備用。土壤pH 為6.1，砂粒質量占比7.4%，粉粒質量占比78.0%，黏粒質量占比14.6%。更多土壤理化性質詳見 Wang 等[27]。

1.2 田間15N2標記盆栽試驗

田間15N2標記盆栽試驗時間為2018年7月23日至2018年10月23日。試驗設種水稻和不種水稻、標記和不標記4個處理，每個處理3次重復。標記的3個重復分別放在3個標記箱中，即每個箱中只放置1個重復。不標記處理的3個重復放在箱外進行(作為自然豐度的對照處理，用于計算標記箱內樣品和空氣的15N原子百分超)。3個15N2標記密閉生長箱(長 × 寬 × 高 = 1 160 mm× 680 mm× 890 mm)平行放置于田間，3個箱體間隔為1 m。用40 L15N2(99 atom%15N)置換箱內40 L空氣，使得3個箱子內的15N豐度為9% 左右。15N2根據Ohyama 和Kumazawa[28]描述的方法進行制備和純化。箱內溫度設定為外界溫度正負1℃，箱內CO2濃度設定為400 μl/L ± 20 μl/L。箱內由于植物光合作用產生的多余氧氣通過除氧劑去除，使得箱內的O2濃度維持在21% 左右。更多關于15N2標記密閉生長箱的設計及其控制系統的信息詳見Bei 等[8]。

試驗時，將土壤樣品風干過篩(<5 mm)后稱取1.3 kg裝入盆(長 × 寬 × 高 = 9 cm × 9 cm × 20 cm)中15 cm高；在盆中澆水至高于土面1 ～ 2 cm，浸泡1周后，每盆施116.37 mg的 KH2PO4和32.55 mg KCl(相當于P2O575 kg/hm2和 K2O 75 kg/hm2)，不施氮肥；然后從大田移栽兩個月大的水稻苗(L.，品種為武運粳23)至盆中，每盆種1棵。所有盆栽均放置在戶外1周，確保秧苗存活后，再放入標記箱內。整個生長季保持盆內1 cm高水層 (烤田期除外) 。每周采集1次箱內氣體，用于觀測箱內15N2變化情況。

1.3 樣品采集及15N2豐度測定

經過90 d的15N2持續標記后，打開標記箱，采集土壤和植株樣品。水稻植株分兩部分采集：地上部(莖葉穗)和地下部(根)。每個盆栽的土樣分三層(0 ～ 1、1 ～ 5、5 ～ 15 cm)采集。一部分土樣作為鮮土放入液氮后，帶回實驗室保存在–80 ℃冰箱用作后續分子實驗；另一部分土樣風干、磨細、過篩(Retsch MM 400 mixer mill，Retsch, Haan, Germany)，用元素分析儀和同位素質譜聯用儀測定其全氮含量和15N豐度(Thermo Finnigan Flash EA-Delta V IRMS聯用儀)。

1.4 土壤DNA及RNA提取

使用RNeasy?PowerSoil?Total RNA Kit(Qiagen) 試劑盒提取土壤總RNA，用RNeasy?MinElute?Cleanup(Qiagen)對總RNA進一步純化，用 Prime Script? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)試劑盒對提取的總RNA進行DNA進一步去除和反轉錄，反轉錄的cDNA保存到–80 ℃冰箱備用。使用RNeasy?PowerSoil?DNA Elution Kit(Qiagen) 試劑盒提取土壤總DNA，提取好的土壤DNA樣品用超微量紫外可見分光光度計(NanoVue Plus，USA)測定純度及濃度，然后保存于–20 ℃備用。

1.5 實時熒光定量PCR (qPCR)

對樣品的DNA及cDNA的基因用引物polF (TGCGAYCCSAARGCBGACTC) / polR (ATSGCCAT CATYTCRCCGGA) 進行定量PCR擴增，程序為：95 ℃，10 min；35循環(95 ℃，30 s；58 ℃，35 s；72℃，45 s)；72℃，10 min。

1.6 數據處理與分析

1) 計算公式。從空氣中固定的氮素占整個水稻–土壤系統全部氮素的比例(%N fixation)可以通過下式計算：

式中：atom%15Nexcesssamples 為標記箱內樣品的15N原子百分超；atom%15Nexcessgas為標記箱內空氣的15N原子百分超。atom%15Nexcesssamples=15N2標記箱內樣品的15N豐度(15N atom%) ? 箱外對照樣品的15N豐度(15N atom%)。atom%15Nexcessgas=15N2標記箱內空氣的15N豐度 ? 箱外空氣的15N豐度。

整個水稻–土壤系統的固氮量 = 樣品總氮(N mg/盆)× %N fixation (2)

固氮活性=固氮量(mg)/RNA基因拷貝數 (3)

2)數據統計分析。文中所有數據均采用SPSS 20.0 統計軟件作單因素方差分析，用Turkey法進行多重比較。

2 結果

2.1 15N2標記箱田間運行情況

3個15N2標記密閉生長箱平行置于水稻田(間隔1 m)，標記時間從2018年7月23日至2018年10月23日，自水稻生長的苗期至成熟期。標記箱內氣體中15N2豐度最高為9.37%，最低為0.80%，平均為3.73%(圖1A)。自動控制密閉標記生長箱內的溫度基本與田間溫度保持一致(圖1B)。箱內CO2濃度在經過一晚上水稻呼吸作用累積后，早上最高達約2 000 μl/L，在經過大約1 h的光合作用消耗后，濃度逐漸降至設定的400 μl/L ± 20 μl/L范圍，隨后白天一直維持在這個范圍(圖1C)。箱內相對濕度在50% ～ 80%(圖1D)。箱內光合作用產生的O2通過定期測量和利用除氧劑(鐵粉)消除，濃度始終維持在2.1×105μl/L (圖1E)。

2.2 稻田土壤中含有的固氮量

經過90 d15N2標記試驗，種水稻處理0 ～ 1 cm土層土壤的總氮量顯著高于不種水稻處理；而其他土層(1 ～ 5 、5 ～ 15 cm)以及整個盆中土壤，種水稻和不種水稻兩處理的總氮量沒有顯著差異(表1)。在所有土層(0 ～ 1、1 ～ 5、5 ～ 15 cm)中，種水稻處理的15N原子百分超和固氮量均顯著高于不種水稻處理。種水稻處理的固氮量在土壤中為4.229 mg/盆，占水稻?土壤系統總固氮量的68.52%；0 ～ 1、1 ～ 5、5 ～ 15 cm各土層的固氮量分別占土壤中總固氮量的39.91%、16.46% 和占43.63%。不種水稻處理的總固氮量為0.599 mg/盆，0 ～ 1、1 ～ 5、5 ～ 15 cm各土層的固氮量分別占土壤總固氮量的53.76%、5.68% 和40.57%。

(A：標記箱內外15N2豐度的動態變化，B：標記箱及箱外田間空氣溫度小時變化值，C：白天標記箱內CO2濃度小時變化值，D：白天標記箱內相對濕度小時變化值，E：標記箱內O2濃度變化值)

表1 15N2標記試驗90 d后，種水稻和不種水稻處理不同土層的總氮量、15N原子百分超和固氮量

注：表中數據為平均值±標準誤差(=3)；同列不同大寫字母表示同一土層種水稻和不種水稻間差異達顯著水平(<0.05)；同列不同小寫字母表示同種處理不同土壤層之間差異達顯著水平(<0.05)。

2.3 水稻中含有的固氮量

水稻根部的總氮量顯著低于地上部，而水稻根部的15N原子百分超顯著高于地上部(表2)。水稻植株固氮量在根部和地上部則沒有顯著差異。生物固氮量在整個水稻植株中的分配為1.943 mg/盆，占種水稻處理水稻?土壤系統總固氮量的31.48%，其中，水稻植株中根占 56.18%，地上部分占43.82%。

2.4 稻田土壤中DNA及cDNA的nifH基因豐度及固氮活性

由圖2A可知，種水稻處理的基因豐度為1.25×106拷貝數/g干土，高于不種水稻處理的0.73×106拷貝數/g干土，但二者差異未達顯著水平。而種水稻處理的反轉錄基因豐度為3.53×104拷貝數/g干土，顯著高于不種水稻處理的1.14×104拷貝數/g干土(圖2B)。種水稻顯著提高了固氮微生物平均固氮活性(圖3)，其固氮活性是不種水稻處理的2.74倍。

表 2 15N2標記試驗90 d后，種水稻處理水稻根和地上部的生物量、總氮量、15N原子百分超和固氮量

注：表中數據為平均值±標準誤差(=3)，同列不同小寫字母表示水稻不同部位間差異達顯著水平(<0.05)。

(圖中誤差線表示標準誤差(n=3)，條形柱上不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)；下同)

圖 3 種水稻和不種水稻盆栽中0 ～ 1 cm土壤中固氮菌固氮活性

3 討論

與不種水稻處理相比，種水稻處理在所有土層(0 ～ 1、1 ～ 5、5 ～ 15 cm)均顯著增加了固氮量(表1)，種水稻處理的總固氮量是不種水稻處理固氮量的10.3倍。生物固氮是一個極耗能的過程，因而也是一個需要碳源較多的過程[29-30]。水稻種植提高生物固氮量，一方面可能是由于水稻根系分泌的大量有機物質為生物固氮過程提供了能量來源[18,31-32]。雖然固氮量因固氮微生物及植物種類的變化而差異較大，但植物通過為細菌生長和固氮菌提供碳源而發揮決定性作用[4]。植物固定的碳有很大一部分被分配到地下部，平均40% 的光合產物被轉移到地下生物量中，而其中通常又有12% 被轉化為根分泌物及其衍生代謝物和微生物生物量碳[33]。另一方面，水稻根系吸收了部分氮素，從而為固氮微生物創造了一定的低氮環境，減少氨抑制作用[34-35]。而且水稻能把大氣中的N2轉運到根部再擴散到根際，從而被根際固氮菌利用[36]。

不論是種水稻處理，還是不種水稻處理，0 ～ 1 cm土層的15N原子百分超均顯著高于1 ～ 5 cm和5 ～ 15 cm，說明距離土壤表面越近，固氮作用越明顯。種水稻處理在0 ～ 1 cm土層的固氮量顯著高于1 ～ 5 cm土層，而與5 ～ 15 cm土層沒有顯著差異，說明0 ～ 1 cm土層雖然固氮作用強烈，但是土壤體積有限，而在5 ～ 15 cm土層，雖然固氮作用不如0 ～ 1 cm土層強烈，但是體量龐大，最終在總的固氮量上并不比0 ～1 cm土層少。另外，種水稻處理的1 ～ 5 cm土層和5 ～ 15 cm土層固氮量對土壤-水稻系統總固氮量的貢獻高于不種植水稻處理，尤其是1 ～ 5 cm土層，種水稻處理1 ～ 5 cm土層的貢獻為16.46%，而不種水稻處理僅為5.68%。這可能是因為在相對較深層土壤中，異養微生物占絕大多數，而異養微生物不能自己產生能源，水稻分泌的能源物質則正好補充了這一點，說明種水稻對異養固氮微生物的促進作用在深層更加明顯[8]。

種水稻顯著提高了RNA基因數量而對基因數量的增加不顯著，說明種水稻沒有顯著增加固氮微生物的數量，而是促進了固氮微生物固氮基因的表達，顯著提高了固氮微生物的活性(圖2、圖3)。這可能與水稻種植對土壤環境的改變及水稻根系分泌物有關。植物通過根系生長影響土壤空間結構[37]，并通過根際分泌物為微生物生長提供基質[38]。植物根系分泌物由糖、有機酸和黏液等低分子化合物組成，是土壤微生物的活性碳源[39]。土壤碳源有效性及其組成是影響土壤微生物活性的關鍵，充足的土壤有效碳源，為生物固氮過程提供了能源，促進了固氮微生物固氮基因的表達[40]。因此，水稻種植雖然沒有增加固氮菌的數量，但是顯著增加了固氮菌固氮基因的表達量，從而顯著提高了稻田生物固氮量。

4 結論

本研究利用15N2直接標記技術測定了稻田固氮量，利用實時熒光定量PCR技術測定了固氮菌基因及其反轉錄基因拷貝數，結果表明，種水稻顯著增加了稻田各層土壤(0 ～ 1、1 ～ 5、5 ～ 15 cm)的固氮量。種水稻和不種水稻的固氮作用都是越靠近土壤表層(0 ～ 1 cm)越強烈，但是種水稻對較深土壤(1 ～ 5 cm和5 ～ 15 cm)固氮作用的促進作用更加明顯。水稻種植沒有增加固氮菌的數量，稻田固氮量的增加是因為水稻種植極大地促進了固氮菌基因的表達，提高了固氮菌的固氮活性。

致謝：本研究的大田試驗得到了江都FACE實驗站的朱國新和實驗室王志玲的幫助，得到了南京土壤研究所劉鋼高級工程師的技術指導，在此表示衷心感謝。

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Effects of Rice Planting on Nitrogen Fixation Amount and Activity in Paddy Field Using15N2Direct Labeling Method

ZHANG Yanhui1, 2, HU Tianlong1,2, WANG Hui1,2, JIN Haiyang1,2, LIU Benjuan1,2, LIU Hongtao1,2, LIU Qi3, LIN Zhibin1,2, LIN Xingwu1,2, XIE Zubin1*

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210008, China)

Paddy N2fixation plays an important role for soil fertility maintenance, however, the relationship between rice planting and activity of diazotrophs to fix N2remains elusive.In this paper the amount of biological nitrogen fixation (BNF) and its distribution in different soil layers (0–1, 1–5, 5–15 cm) and rice were measured by15N2direct labeling method.The abundances of nitrogen fixing bacteria and active nitrogen fixing bacteria in soil were determined by real-time quantitative PCR (qPCR).The results showed that rice planting significantly increased nitrogen fixation amount in each soil layer, and also increased the contribution of 1–5 cm and 5–15 cm layers to total nitrogen fixation.Total nitrogen fixation amount in rice planting treatment was 10.3 times higher than CK.The fixed N2allocated to rice plants accounted for 31.48% of the total nitrogen fixation.In 0–1cm soil layer, rice planting significantly increased the number ofRNA gene, but did not significantly increase the number ofDNA gene.These results indicated that rice planting did not increase the number of nitrogen fixing bacteria.The increase of nitrogen fixation amount in rice field is because rice planting greatly promoted the expression ofgene of nitrogen fixing bacteria, thus improved nitrogen fixation activity of nitrogen fixing bacteria.

Biological nitrogen fixation; Nitrogen fixation activity; Paddy field;15N2direct labeling method;reverse transcription

S51；S-3

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.04.010

張燕輝, 胡天龍, 王慧, 等.利用15N2直接標記法研究水稻種植對稻田固氮量和固氮活性的影響.土壤, 2021, 53(4): 739–745.

國家科技基礎性工作專項(2015FY110700)和國家自然科學基金項目(31870500；41501273)資助。

(zbxie@issas.ac.cn)

張燕輝(1988－)，男，湖南懷化人，博士研究生，主要從事稻田生物固氮研究。E-mail: yhzhang@issas.ac.cn