2’-巖藻糖基乳糖生物合成專利技術(shù)研究進(jìn)展

李云飛，欒慶民，劉 峰，孫桂蓮，張 莉，李珍珍，李克文,

（1.保齡寶生物股份有限公司，山東 禹城 251200；2.山東省功能糖提取與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 禹城 251200；3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL，F(xiàn)ucα-1,2-Gal-β-1,4-Glc）由D-葡萄糖（D-glucose，Glc）、D-半乳糖（D-galactose，Gal）和L-巖藻糖（L-fucose，F(xiàn)uc）構(gòu)成，是人乳寡糖中含量最豐富的低聚糖，在人乳中含量為2～5 g/L，約占已檢出人乳總寡糖的30%[1]。人乳寡糖是嬰兒發(fā)育不可或缺的成分，有助于嬰兒腸道中雙歧桿菌屬（Bifidobacteria）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）等益生菌的生長，有助于預(yù)防病原菌感染，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，促進(jìn)嬰兒大腦早期發(fā)育等功能[1-2]。

2’-FL作為食品添加劑新品種，已在國外嬰兒配方乳粉、乳制品和特殊用途食品中使用[3]。有多家大型生產(chǎn)商推出產(chǎn)品，例如丹麥Glycom A/S公司、德國Jennewein Biotechnologie GmbH公司、美國GlycoSyn LLC公司、比利時(shí)Inbiose（杜邦營養(yǎng)）公司、韓國GeneChem公司等[4-5]， 這些公司主要是利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2’-FL。在發(fā)酵生產(chǎn)能力方面，發(fā)酵效價(jià)已達(dá)到180 g/L[6]，發(fā)酵罐容積已達(dá)200 m3以上[7]。在產(chǎn)品質(zhì)量與安全規(guī)范方面，先后有多家國外機(jī)構(gòu)頒布法規(guī)或更新條文，如美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Adiministration，F(xiàn)DA）的GRAS（generally recognized as safe）安全認(rèn)定、歐盟委員會(huì)的系列法規(guī)（EU 2016/375、EU 2016/376、EU 2017/2201、EU 2017/2470、EU 2019/388）、澳大利亞/新西蘭食品標(biāo)準(zhǔn)局通告（2019/1190號(hào)、2019/1155號(hào)）等，從食品藥品質(zhì)量安全角度通過了產(chǎn)自大腸桿菌K-12和大腸桿菌BL-21（DE3）的2’-FL作為食品新資源的認(rèn)證，明確了2’-FL純度和最大使用量，并要求在食品成分表中標(biāo)明“2-O-FL”[8-10]。我國近幾年在2’-FL生物合成重組菌株構(gòu)建方面發(fā)展較快，有多家高校、科研機(jī)構(gòu)和企業(yè)投入其中，發(fā)表了大量研究論文，申請(qǐng)了多項(xiàng)發(fā)明專利。在規(guī)范制定方面，國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心于2016年 8月15日公布關(guān)于2’-FL作為食品添加劑新品種的征求意見書，其中明確了2’-FL的功能、用量、生產(chǎn)工藝（大腸桿菌（Escherichia coli）BL-21（DE3）菌株作為加工助劑）、產(chǎn)品規(guī)格和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（感官要求、理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)）等[11]。上述學(xué)術(shù)理論研究、專利技術(shù)和質(zhì)量安全規(guī)范制定等方面的成果為相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。本文重點(diǎn)關(guān)注我國近幾年關(guān)于2’-FL的相關(guān)專利技術(shù)，期望加快推動(dòng)我國的2’-FL生物合成早日實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和規(guī)模化。

1 我國2’-FL相關(guān)專利技術(shù)概況

由圖1可知，根據(jù)萬方中外專利數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)[12]，以“巖藻糖基乳糖”為題目共檢索到申請(qǐng)我國專利38 條，其中多數(shù)集中在近2 年。從申請(qǐng)人或申請(qǐng)單位看，早期主要是國外公司或國外技術(shù)人員，如丹麥Glycom A/S公司、德國Jennewein Biotechnologie GmbH公司、德國巴斯夫（BASF）歐洲公司等。

圖1 申請(qǐng)我國巖藻糖基乳糖專利情況（統(tǒng)計(jì)至2021年4月）[12-15]Fig. 1 Number of fucosyllactose-related patents applied for in China during 2012-2021 (updated to April 2021)[12-15]

南開大學(xué)王磊等[13]申請(qǐng)專利CN106190937A（2016-12-07），是我國較早、為數(shù)不多利用基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建產(chǎn)2’-FL菌株的單位之一。近2 年申請(qǐng)專利的單位或個(gè)人多數(shù)是我國的科研單位或科技人員，如江南大學(xué)劉龍等[14]。 從專利技術(shù)內(nèi)容看，我國申請(qǐng)的專利更多集中在生產(chǎn)2’-FL的重組菌株構(gòu)建方面，占比約80%以上，其次是巖藻糖基乳糖生物功能研究及配方產(chǎn)品開發(fā)方面；而國外申請(qǐng)的專利內(nèi)容涉及到巖藻糖基乳糖的化學(xué)合成法[15-17]或分離純化技術(shù)，如結(jié)晶法[18-19]、噴霧干燥法[20-21]等工程問題，也涉及到益生元產(chǎn)品開發(fā)等問題[22]。在 圖1統(tǒng)計(jì)的關(guān)于巖藻糖基乳糖的專利中，93%以上是關(guān)于 2’-FL，而關(guān)于3-FL的專利不足10%。

2 生物發(fā)酵法生產(chǎn)2’-FL

微生物（以大腸桿菌為例）全細(xì)胞合成生產(chǎn) 2’-FL，主要有2 條途徑，一條是從頭合成途徑（De novopathway），一條是補(bǔ)救途徑（Salvage pathway）（圖2）。 從頭合成途徑是指細(xì)胞利用胞外葡萄糖或甘油或蔗糖等材料作為碳源和能源，從胞內(nèi)糖酵解途徑中間產(chǎn)物果糖-6-磷酸開始分支進(jìn)入5’-鳥苷二磷酸（5’-guanosinediphosphate，GDP）-L-巖藻糖途徑，其間在甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶（mannose 6-phosphate isomerase，manA）、磷酸甘露糖變位酶（phosphomannomutase，manB）、甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶（mannose-1-phosphate guanylyl transferase，manC）、GDP-D-甘露糖-6-脫氫酶（GDPD-mannose 6-dehydrogenase，gmd）和GDP-L-巖藻糖合成酶（GDP-L-fucose synthase，wcaG）的順序催化作用下，合成GDP-L-巖藻糖；之后以GDP-L-巖藻糖為供體，以底物乳糖為受體，在異源巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1,2-fucosyltransferase，futC）催化下合成2’-FL，并輸出到胞外[23-25]。補(bǔ)救途徑是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或共生微生物細(xì)胞內(nèi)合成GDP-L-巖藻糖的途徑，只能以胞內(nèi)或胞外L-巖藻糖為底物，在L-巖藻糖激酶/L-巖藻糖焦磷酸化酶（L-fucokinase/L-fucose 1-phosphate guanylyltransferase，fkp） 雙酶作用下轉(zhuǎn)化成GDP-L-巖藻糖，并由futC進(jìn)一步催化合成2’-FL[23-25]。2 條途徑所用合成底物和代謝途徑均有較大差異，從頭合成途徑是由葡萄糖或甘油或蔗糖等廉價(jià)材料合成2’-FL，工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)可行性高，但是由于合成路徑長、代謝支路多，代謝效率較低。補(bǔ)救途徑合成路徑短，但是以自然界稀少的L-巖藻糖為合成底物，工業(yè)化生產(chǎn)成本較高。針對(duì)上述問題，專利技術(shù)圍繞圖2所示的合成代謝途徑，采取敲除特定基因和/或過表達(dá)特定基因等方法，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化代謝途徑的目的。重組菌合成代謝專利技術(shù)主要集中在以下方面。

圖2 2’-FL重組菌合成代謝途徑[23-25]Fig. 2 Metabolic pathway for 2’-FL biosynthesis by recombinant strain[23-25]

2.1 提高宿主細(xì)胞內(nèi)GDP-L-巖藻糖和乳糖的積累量

GDP-L-巖藻糖和乳糖是生產(chǎn)2’-FL的供體和受體。GDP-L-巖藻糖是某些微生物（如大腸桿菌）合成細(xì)胞莢膜異多糖酸的中間產(chǎn)物。野生型菌株合成GDP-L-巖藻糖的量非常少，作為合成2’-FL的供體無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，被認(rèn)為是生產(chǎn)2’-FL合成途徑中一個(gè)瓶頸。外加L-巖藻糖（如補(bǔ)救途徑）雖有效果，但是成本問題限制了工業(yè)化生產(chǎn)。因此，專利技術(shù)都集中在從頭合成途徑中相關(guān)合成酶的過表達(dá)方面，強(qiáng)化陽性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，敲除或弱化分解GDP-L-巖藻糖的相關(guān)酶基因。乳糖作為合成2’-FL的受體材料，主要通過外加的方式供給，相關(guān)專利技術(shù)主要集中在提高重組菌株細(xì)胞膜的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶（lactose permease，lacY）活性方面，以及阻斷或降低乳糖胞內(nèi)分解和轉(zhuǎn)化問題。提高胞內(nèi)GDP-L-巖藻糖和乳糖含量的策略可謂“開源節(jié)流”。張濤等[26]以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主，通過不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒組合過表達(dá)2’-FL從頭合成途徑中的相關(guān)酶（manB、manC、gmd、wcaG、lacY、futC），并利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除lacZ和5’-尿苷-二磷酸-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶wcaJ的基因，阻止乳糖和GDP-L-巖藻糖的轉(zhuǎn)化分解；采用補(bǔ)料分批發(fā)酵，在3 L發(fā)酵罐內(nèi)2’-FL的產(chǎn)量達(dá)52 g/L。帥玉英等[27]同樣以大腸桿菌BL21（DE3）為生產(chǎn)宿主，除了過表達(dá)2’-FL合成途徑中相關(guān)酶（manB、manC、gmd、wcaG、futC）的基因外，還過表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（scrB和scrY），敲除lacZ基因，并利用大腸桿菌同源整合系統(tǒng)，將構(gòu)建的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因lacY高效表達(dá)閱讀框整合到重組菌株中，突出強(qiáng)化了蔗糖和乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶基因的表達(dá)；在3L發(fā)酵罐中流加蔗糖發(fā)酵，發(fā)酵液2’-FL含量達(dá)100 g/L。倪志堅(jiān)等[28]以大腸桿菌為宿主，除過表達(dá)GDP-L-巖藻糖合成途徑中所必需的酶manA、manB、manC、gmd、wcaG和外源futC外，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和傳統(tǒng)λ-Red同源重組系統(tǒng)，敲除或突變大腸桿菌的甘露糖水解酶、lacZ或半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶（β-galactoside-transacetylase，lacA）、wcaJ、mtlD和lon的編碼序列，過表達(dá)大腸桿菌的陽性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子rcsA和rcsB基因；在相同條件下，該專利技術(shù)逐一比較敲除上述每個(gè)蛋白酶（lacZ、lacA、wcaJ、lon、mtlD）基因?qū)铣蒅DP-L-巖藻糖和2’-FL的影響，結(jié)果顯示，敲除上述每個(gè)蛋白酶基因?qū)铣蒅DP-L-巖藻糖和2’-FL都有較明顯的效果；經(jīng)過5 L罐發(fā)酵（以甘油為底物），GDP-L-巖藻糖最高產(chǎn)量約400 mg/L，2’-FL為50 g/L。

2.2 futC表達(dá)

futC是催化GDP-L-巖藻糖與乳糖形成α-1,2-糖苷鍵的關(guān)鍵酶，其活性影響2’-FL的產(chǎn)量。在原核生物中，最早在病原菌幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）中克隆出futC，是大腸桿菌等工程菌中合成2’-FL的主要外源蛋白酶（使用該蛋白酶的專利占本文統(tǒng)計(jì)專利數(shù)的85%以上）。隨著對(duì)futC構(gòu)效關(guān)系的認(rèn)識(shí)，部分專利技術(shù)采用人工合成或經(jīng)過修飾的futC序列。孫俊松等[29]在大腸桿菌重組菌中表達(dá)人工合成的futC序列，并證明該合成序列為功能完全的α-1,2-futC。帥玉英等[27]基于幽門螺旋桿菌futC序列和大腸桿菌密碼子的偏好性重新合成futC序列。徐鎮(zhèn)浩等[30]基于谷氨酸棒狀桿菌生化特性，對(duì)源于幽門螺旋桿菌的futC序列進(jìn)行優(yōu)化，獲得較好的效果。劉龍等[31]將幽門螺旋桿菌的futC N端與4 種蛋白融合標(biāo)簽柔性連接，提高了futC的可溶性和生物活性。吳志剛等[32]以大腸桿菌JM109（DE3）作為原始菌株，通過表達(dá)含有柔性多肽串聯(lián)連接的2 個(gè)futC基因，增強(qiáng)了GDP-巖藻糖與乳糖的合成。除了基于幽門螺旋桿菌的futC外，專利技術(shù)中也出現(xiàn)異源表達(dá)其他微生物的futC。申哲壽等[33]比較2 種微生物的futC，在相同條件下，表達(dá)源自舞蹈擬土地桿菌（Pseudopedobater saltans）futC基因的重組菌，其2’-FL產(chǎn)量是表達(dá)幽門螺旋桿菌的futC重組菌產(chǎn)量的2 倍。孟祥鋒等[34]比較6 種不同微生物來源的futC對(duì)2’-FL產(chǎn)量的影響，在相同條件下，幽門螺旋桿菌、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、均勻擬桿菌（Bacteroides unifomis）、蛋狀擬桿菌（Bacteroideseggerthii）、Neocallimastix californiae6 種微生物中，源于蠟樣芽孢桿菌的重組菌2’-FL產(chǎn)量最高。

2.3 重組菌的生物安全性

作為重組菌的宿主微生物，大腸桿菌無疑是優(yōu)選的，其具有遺傳背景清楚、基因操作方便、生長繁殖快、易于放大等特性，作為生產(chǎn)2’-FL宿主菌有明顯的優(yōu)勢(shì)。美國FDA、歐盟食品安全條例和我國相關(guān)征求意見稿中均明確大腸桿菌為生產(chǎn)菌，國外廠商也有成功的案例，例如，丹麥Glycom A/S公司（生產(chǎn)2’-FL、乳糖-N-新四糖、雙巖藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖）、美國GlycoSyn LLC公司（生產(chǎn)2’-FL）、比利時(shí)Inbiose公司（生產(chǎn)2’-FL）均使用大腸桿菌K-12作為生產(chǎn)菌種，而德國Jennewein Biotechnologie GmbH公司（生產(chǎn) 2’-FL）使用大腸桿菌BL21作為生產(chǎn)菌種[6]。大腸桿菌作為工業(yè)化生產(chǎn)菌株的優(yōu)勢(shì)毋庸置疑，在本文統(tǒng)計(jì)的專利文獻(xiàn)中也占有較高比例（73%）。但是，大腸桿菌細(xì)胞外膜的脂多糖層有產(chǎn)內(nèi)毒素活性，用于生產(chǎn)食品藥品的原材料，其潛在風(fēng)險(xiǎn)也不可忽視。在專利技術(shù)中有2 種解決方法：1）提高大腸桿菌發(fā)酵液的分離純化技術(shù)，將發(fā)酵菌體及其代謝副產(chǎn)物（如蛋白質(zhì)、氨基酸、脂多糖、核酸和其他生物分子）分離出去，提高產(chǎn)品純度[18-21]；2）選育更安全、高效的重組菌。谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、乳酸乳球菌、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等微生物是食品工業(yè)中生產(chǎn)氨基酸、核酸、酶制劑、營養(yǎng)化學(xué)品等原材料或酒飲料的生產(chǎn)菌，其生物安全性優(yōu)于大腸桿菌。劉龍等[35-36]為了解決枯草芽孢桿菌對(duì)乳糖利用率低的問題，構(gòu)建由P43啟動(dòng)子和lacY基因序列構(gòu)成的替換框，通過同源重組技術(shù)替換枯草芽孢桿菌168的α-淀粉酶基因amyE位點(diǎn)，提高了枯草芽孢桿菌重組菌對(duì)乳糖的利用率。徐鎮(zhèn)浩[30]、 申哲壽[33]等利用谷氨酸棒狀桿菌作為生產(chǎn)宿主菌，在過表達(dá)內(nèi)源manB和manC基因基礎(chǔ)上，異源表達(dá)源自大腸桿菌K-12MG1655的gmd、wcaG、lacY基因和源自舞蹈擬土地桿菌的futC基因。通過補(bǔ)料分批培養(yǎng)持續(xù)供給葡萄糖或乳糖，菌株生長活躍，提高了2’-FL產(chǎn)量。孟祥鋒[34]、 劉巍峰[37]等利用釀酒酵母W303-1a為宿主菌，通過同源重組或定點(diǎn)誘變等技術(shù)將來源于蠟樣芽孢桿菌的futC基因、來源于乳酸克魯維斯酵母菌的乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶lac12基因、來源于大腸桿菌K12的gmd和wcaG基因整合入釀酒酵母中。重組菌株不但具有乳糖利用功能，而且具有一個(gè)或多個(gè)拷貝的重組基因或DNA序列，從而高效表達(dá)了異源蛋白酶。

2.4 重組菌的遺傳穩(wěn)定性

為了過表達(dá)2’-FL合成途徑中相關(guān)酶，在重組菌株構(gòu)建過程中往往采用多拷貝數(shù)的表達(dá)質(zhì)粒。這些質(zhì)粒在細(xì)胞生長繁殖過程中丟失與否是重組菌遺傳穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一，也是影響工業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量和效益的重要因素。在專利技術(shù)中，劉龍等[31]利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在大腸桿菌MG1655鞭毛驅(qū)動(dòng)蛋白基因fliR位點(diǎn)上整合外源futC基因，在L-墨角藻糖激酶基因fuck位點(diǎn)上整合外源fkp基因，獲得了高效合成2’-FL的無質(zhì)粒工程菌株。張濤等[26]經(jīng)過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，從36 株重組菌 （BL21(DE3)，ΔlacZ、ΔwcaJ）BZW 1～36中挑選出含有不同質(zhì)粒的5 株菌株（BZW 1～5），且經(jīng)過6 代培養(yǎng)，2’-FL產(chǎn)量均保持穩(wěn)定，表明實(shí)驗(yàn)菌株遺傳穩(wěn)定性良好。

續(xù)表1

2’-FL生物合成重組菌株構(gòu)建部分相關(guān)專利如表1所示。

表1 2’-FL生物合成重組菌株構(gòu)建部分相關(guān)專利Table1 Patents on the construction of recombinant strain for 2’-FL biosynthesis

3 結(jié) 語

從上述專利內(nèi)容和數(shù)量看，我國專利技術(shù)更多集中在高效、安全重組菌株的構(gòu)建方面。采用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)和/或傳統(tǒng)的λ-Red同源重組系統(tǒng)，優(yōu)化2’-FL合成代謝途徑。利用不同拷貝數(shù)的表達(dá)質(zhì)粒或強(qiáng)啟動(dòng)子過表達(dá)相關(guān)酶的基因，提高了部分關(guān)鍵酶的表達(dá)量。在生物安全性方面，多項(xiàng)專利選擇了安全性更高的谷氨酸棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等微生物作為宿主菌，內(nèi)源基因與外源基因得到互補(bǔ)。

構(gòu)建安全、高效的重組菌株是2’-FL工業(yè)化生產(chǎn)的第1步，雖然微生物合成2’-FL的路徑已經(jīng)明確，但是不同菌株在不同環(huán)境下代謝效率差異很大，優(yōu)化代謝途徑和代謝條件還有很大空間。其次，中試放大過程及發(fā)酵液分離純化技術(shù)與成本是產(chǎn)品走向市場成敗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在上述申報(bào)專利技術(shù)中，重組菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)仍局限在實(shí)驗(yàn)室搖瓶或小型實(shí)驗(yàn)發(fā)酵罐內(nèi)（5 L以下），在中試條件下甚至生產(chǎn)條件下菌株的代謝特性和遺傳特性有待研究。雖然目前工業(yè)上已有較多的分離純化技術(shù)供選擇（如膜分離、離子交換、活性炭吸附、色譜分離、結(jié)晶和干燥等），但是發(fā)酵液的組成和流動(dòng)特性均影響產(chǎn)品的分離純度和成本，產(chǎn)品純度、分離純化技術(shù)選擇和分離純化效率有待優(yōu)化。