氣相色譜-串聯質譜法測定豆乳中12 種有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留

謝瑞龍，梁建英

（內蒙古伊利實業集團股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 010110）

有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑因具有廣譜、高效、廉價等優點，已被廣泛用于農業生產的蟲害防治過程中。但由于這些農藥的不合理使用，不但對生態環境造成破環，藥物殘留還直接威脅到人類的身體健康[1-2]。 根據作用機制，這2 類農藥會抑制動物或人體內乙酰膽堿酯酶的活性，造成乙酰膽堿不斷累積，影響其正常傳導，導致中毒現象的發生；若在人體內長期蓄積還會致畸、致癌、致突變，甚至死亡[3-5]。

豆乳作為植物乳的一種，因其含有豐富的營養成分，有助于調節內分泌、預防骨質疏松癥、更年期綜合征以及心血管疾病等，所以越來越受到消費者 喜愛[6-7]。目前，豆乳中有機磷及氨基甲酸酯類農藥檢測方法少有文獻研究，而植物源性食品的檢測方法有酶抑制法[8]、酶聯免疫法[9]、氣相色譜法[10-11]、液相色 譜法[12-13]、氣相色譜-質譜法[14-15]、氣相色譜-串聯質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS） 法[16-17]、液相色譜-串聯質譜法[18-19]等。其中，GC-MS/MS法具有靈敏度高、特異性強、分離效果好等優點，是多種農藥殘留定量分析的主要手段。為了保障豆乳產品的質量安全，避免受到農藥殘留污染的風險，本研究利用QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）的前處理方法，通過優化關鍵步驟，建立一種GC-MS/MS同時測定豆乳中12 種常見有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留量的方法。這將為其他植物乳中農藥殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆乳樣品：植選濃香豆乳、植選植物乳、植選濃香豆乳（黑芝麻、黑豆） 內蒙古伊利實業集團股份有限公司。

無水硫酸鎂（MgSO4）、氯化鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物（檸檬酸氫二鈉）、醋酸鈉（均為分析純） 美國安捷倫科技有限公司；乙酸乙酯（色譜純）、乙腈（農殘級）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化炭黑、含12 種農藥（溴硫磷、三硫磷、毒蟲畏、毒死蜱、甲基毒死蜱、蠅毒磷、甲基嘧啶磷、仲丁威、苯硫威、異丙威、抗蚜威、殘殺威）的混標（100 μg/mL）、環氧七氯B（內標，1 mg/mL） 上海 安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

TQS9000氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（配有電子轟擊離子源） 美國Thermo Fisher Scientific公司；Biofuge Stratos低溫高速離心機 德國Sigma公司；分析天平（感量0.000 1 g） 瑞士Mettler Toledo公司；TurboVap LV氮吹儀 瑞典Biotage公司；KS501渦旋振蕩器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取10.0 g豆乳樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min；然后在冷水浴條件下加入4.0 g MgSO4、1.0 g氯化鈉、1.0 g檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸氫二鈉后，繼續振蕩5 min，4 ℃、4 200 r/min離心5 min；取7.0 mL上清液有機層至內含1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18的15 mL離心管中，振蕩5 min，4 ℃、4 200 r/min離心5 min；取4.0 mL上清液至氮吹管中，40 ℃氮吹至近干；加入20 μL 5 μg/mL內標溶液，乙酸乙酯復溶至1.0 mL，過濾后供GC-MS/MS測定分析。

1.3.2 標準工作溶液配制

采用空白基質加標的方式，稱取不含待測農藥的樣品按上述操作制備樣品空白提取液，空白基質溶液氮氣吹干后，加入20 μL 5 μg/mL內標溶液，依次加入一定體積的混合標準品工作液，用乙酸乙酯稀釋定容至1.0 mL，配制成質量濃度梯度為5、10、20、50、100、150、200 ng/mL的12 種化合物的混合標準工作溶液。現用現配。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：5%苯基-甲基聚硅氧烷石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1.5 min，以25 ℃/min升溫至90 ℃，并保持1.5 min，以25 ℃/min升溫至180 ℃，以5 ℃/min升溫至280 ℃，以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min；進樣量1 μL；進樣方式：不分流進樣。

1.3.4 質譜條件

電離方式：電子轟擊源；電離能量70 eV；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲6 min；監測方式：選擇反應監測模式，12 種農藥及環氧七氯B的保留時間、定量離子對、定性離子對和碰撞電壓參見表1。

1.3.5 結果計算

12 種農藥的含量計算公式如下。

式中：X為試樣中被測組分殘留量/（mg/kg）；ρ為由標準工作曲線得到的被測組分質量濃度/（ng/mL）；V為樣品溶液定容體積/mL；m為試樣質量/g；n為稀釋倍數；1 000為換算系數。

1.4 數據處理

使用Tracefinder 4.1軟件處理標準工作曲線，得到被測組分質量濃度；使用WPS Office 2020軟件繪制簇狀柱形圖。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的確定

為了選擇合理的前處理方法，本研究參照植物源性食品基質，對GC法和GC-MS法測定有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留的國內標準進行總結。由表2可知，總體而言，前處理方法可分為液-液萃取、固相萃取柱及分散固相萃取3 種方式。其中，GB/T 5009.145—2003《植物性食品中有機磷和氨基甲酸酯類農藥多種殘留的測定》[11]的前處理步驟采用丙酮水溶液提取，二氯甲烷二次提取，硅膠柱凈化，最后濃縮定容。該方法的實驗步驟復雜，且需要消耗大量有機試劑，對環境及人員危害較大。NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農藥多殘留的測定》[20]為多個方法的合集，對于有機磷類農藥，采用液-液萃取，乙腈提取，過濾濃縮后定容；對于氨基甲酸酯農藥，采用乙腈提取，經氨基柱凈化，氮吹復溶上樣。該方法操作較麻煩，需要在80 ℃水浴條件下加熱濃縮，且樣品凈化不夠充分，不適用于復雜的樣品基質，不利于儀器長時間使用。對于DB34/T 1076—2009《蔬菜、水果、糧食、茶葉中40 種有機磷和氨基甲酸酯類農藥多殘留同時測定方法 氣相色譜法》[21]和GB 23200.8—2016《食品安全國家標準 水果和蔬菜中500 種農藥及相關化學品殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》[22]，前處理有了明顯改進，采用乙腈提取-固相萃取柱凈化的前處理方法，溶劑的使用量及操作步驟部分減少。GB 23200.113—2018《食品安全國家標準 植物源性食品中208 種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法》[16]中除提供了乙腈提取-石墨化炭黑/氨基復合柱凈化的方法外，還推薦了QuEChERS前處理方法。研究表明，QuEChERS整個過程操作簡單、試劑用量少、環境污染小、處理時間短[23]。綜上所示，結合實際實驗操作，本研究最終確定采用QuEChERS前處理法。

2.2 萃取步驟中降溫方式的選擇

QuEChERS法提取時會加入MgSO4，可以更好地促使水相與有機相分層。然而MgSO4遇水會放出大量的熱，容易導致部分農藥分解，最終影響目標物的提取效率。為了避免這一問題的發生，本研究采用水傳導散熱的原理，快速釋放MgSO4遇水產生的熱量，降低實驗體系的溫度。優化后的實驗流程為在冷水浴條件下向離心管中加入鹽包。

將冷水浴降溫與傳統方式（常溫實驗環境）降溫進行對比實驗，每組做3 次平行。由圖1可知，2 種降溫方式的平均加標回收率分別為82.3%～97.6%和67.0%～85.8%；在冷水浴條件下，所有目標物的平均加標回收率優于傳統方式處理，其中異丙威效果最明顯，其平均加標回收率提升15.3%。因此，本研究選擇在冷水浴條件下進行實驗。

圖1 2 種降溫方式對12 種農藥平均加標回收率的影響 （加標量0.004 mg/kg）Fig. 1 Effect of two cooling methods on average recoveries of 12 pesticides at spiked concentration of 0.004 mg/kg

2.3 凈化步驟中凈化包的選擇

為了確定合適的QuEChERS凈化包，結合國標 GB 23200.113—2018《食品安全國家標準 植物源性食品中208 種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯用法》中蔬菜、水果及谷物的前處理實驗，以及其他文獻調研的結果[16,24]，本研究選取2 組通用型的凈化填料進行對比實驗：第1組為1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18；第2組為885 mg MgSO4、150 mg PSA和15 mg GCB，每組做3 次平行。

由圖2可知，2 組實驗的平均加標回收率分別為87.7%～99.9%和76.4%～110.3%，除溴硫磷、蠅毒磷及殘殺威外，其余9 種目標物在MgSO4＋PSA＋C18條件下凈化，平均加標回收率更優。因此，本研究選擇通用型凈化包1 200 mg MgSO4、400 mg PSA和400 mg C18。

圖2 2 種凈化包對12 種農藥平均加標回收率的影響 （加標量0.004 mg/kg）Fig. 2 Effect of two dispersive solid phase extraction kits on average recoveries of 12 pesticides at spiked concentration of 0.004 mg/kg

2.4 標準曲線和定量限

本研究采用內標法進行定量，將基質標準溶液依次進樣后采集數據，以目標物和內標的定量離子對峰面積比值為縱坐標，二者之間的質量濃度比為橫坐標，繪制標準曲線。

由表3可知，在5～200 ng/mL質量濃度范圍內，12 種有機磷及氨基甲酸酯類農藥的標準曲線線性關系良好，相關系數均大于0.99。12 種農藥的定量限均為 0.004 mg/kg，滿足信噪比（RS/N）≥10的要求。

表3 12 種農藥的標準曲線和定量限Table3 Calibration curves and LOQs for 12 pesticides

2.5 方法回收率和精密度

選擇空白豆乳樣品進行0.004、0.008、0.040 mg/kg 3 個不同水平的加標實驗，每個水平均做6 次平行，測定加標回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

由表4可知，12 種農藥的加標回收率為71.8%～114.9%，RSD為4.6%～13.3%，說明該方法滿足要求，適用于豆乳中目標農藥殘留的測定。在實際樣品檢測中，利用所建立的方法對市售的5 批次豆乳進行12 種有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測，結果均未檢出。

表4 12 種農藥的加標回收率及RSD（n＝ 6）Table4 Recoveries and RSDs for 12 pesticides (n = 6)

2.6 實際樣品測定

隨機抽取3 種常見豆乳產品進行檢測，分別稱取10 g植選濃香豆乳、植選植物乳、植選濃香豆乳（黑芝麻、黑豆），按照方法操作步驟進行12 種農藥殘留檢測，結果均未檢出，與樣品實際情況相符，表明此方法適用。

3 結 論

本研究提供了一種同時測定豆乳中12 種有機磷及氨基甲酸酯類農藥殘留的GC-MS/MS方法。在其他食品基質文獻的基礎上，采用QuEChERS前處理方法，在提取步驟中引入冷水浴降溫方式，較好地提升了目標物的加標回收率；在凈化步驟中對通用型凈化包進行了加標回收率對比實驗，確定了合適比例的凈化包；同時采用內標法進行定量。方法學驗證實驗結果顯示：12 種農藥的定量限均為0.004 mg/kg，3 個不同添加水平下的加標回收率為71.8%～114.9%，RSD為4.6%～13.3%，加標回收率和精密度滿足要求。該方法具有快速、高效、準確的優點，適用于豆乳中有機磷及氨基甲酸酯農藥殘留的測定，也可為其他植物乳中農藥殘留檢測方法的研究及應用提供參考。