硝苯地平對大鼠牙齦退縮的治療研究

姜春慧，陳永吉，李孝迪，紀 悅，胡佳敏，楊如會

（麗水學院醫學院，浙江麗水 323000）

牙齦退縮，指牙齦緣向釉牙骨質界的根方退縮導致的牙根暴露，多為牙周炎的伴發病變，其主要病理改變為牙齦組織中膠原纖維的減少、膠原排列稀疏、黏附性降低等，嚴重的牙齦退縮可伴發牙槽骨的吸收[1]。牙齦退縮是導致食物嵌塞、牙齒松動和脫落等口腔疾病的重要原因[2]。牙齦退縮目前尚缺乏特效治療方法，尋找有效的治療牙齦退縮的防治藥物對改善口腔衛生具有重要意義。

硝苯地平（Nifedipine,Nif）是預防和治療冠心病、心絞痛的常用藥物，藥物性牙齦增生是硝苯地平特有的不良反應之一[3]。目前認為Nif能夠誘導牙齦角質細胞生長因子及其受體誘導膠原合成，促進牙齦組織Wnt1和β-catenin的基因和蛋白表達[4]；并通過干擾細胞內鈣離子流動降低整合素α2β1結合力，從而降低整合素介導的成纖維細胞的吞噬膠原的功能[5]。Nif通過上述作用增加牙齦膠原的產生并減少膠原的降解。上述研究表明，Nif對牙齦組織的作用，提示Nif可能具有增加退縮牙齦細胞修復增殖能力及改善牙齦退縮的作用。本研究擬通過動物模型試驗驗證該假說，為開發防治牙齦萎縮的藥物做研究基礎，并對牙齦退縮的機制做探討。

1 材料與方法

1.1 材料

Nif平標準品（中檢所，批號：100338）；脂多糖（LPS,Sigma，L2630）；成年SD大鼠40只，體重220±20g，雌雄各半，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005；病理HE染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，D006-1-1）；Masson染色試劑盒（Solarbio，G1345）；TGF-β1一抗（abcam，ab190503）、Keratin 5（Krt5）一抗（abcam，ab64081）；離心柱形RNA提取試劑盒（上海捷瑞生物工程公司，GK3016）；RT SuperMix逆轉錄試劑盒（南京諾唯贊生物公司，貨號R222-01）；定量PCR試劑盒（南京諾唯贊生物公司，Q411-02）；Micro-CT（Genoray，Papaya 3D Plus）；游標卡尺（晶思達，JSD-KC）；定量PCR儀（BIO-RAD，CFX Connect Real-Time System）；顯微鏡（OLYMPUS，BX43）。

1.2 Nif水凝膠的制備

分別把Nif標準品（中檢所，批號：100338）100 mg和50 mg分別溶于50 mL2%羧甲基纖維素鈉溶液中，磁轉子攪拌2 h，分別制備成1 mg/mL和2 mg/mL濃度的Nif水凝膠，4℃冷藏儲備。

1.3 動物分組

針對牙齦退縮的主要原因，設計大鼠牙齦退縮模型。按體重隨機分為4組，分別為空白對照組（Control）、模型組（Model）、模型+Nif高劑量（2 mg/mL）組、模型+Nif低劑量組（1 mg/mL）。每組8～10只，屏障動物實驗室喂養，溫度22℃～26℃，相對濕度60%～80%，常規標準大鼠顆粒飼料喂養。

1.4 牙齦退縮模型復制方法

參考相關文獻[6-7]，采用改良手術方法復制大鼠牙齦退縮模型：SD大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉6 mL/kg麻醉。大鼠被固定于手術板上，使其面部朝上，固定四肢，大鼠開口器分開上下頜，暴露上頜磨牙區，碘伏對上頜磨牙及近中黏膜區進行表面消毒，沿著大鼠上頜第一磨牙近中端部位用刀片割開3 mm左右，暴露上頜近中牙齦，并剝離牙齦組織，手持牙科低速手機，以400～500 r/min的轉速用慢速球鉆在上頜第一磨牙近中端的牙齦下組織制備骨缺損（4 mm×2 mm×2 mm）。傷口用醫用縫合線小心縫合，縫合后進行表面消毒。實驗完畢后，將大鼠放置于實驗室的鼠籠中，定期觀察大鼠，正常飲食。大鼠牙齦傷口可在術后數天內痊愈，同時每天用棉簽在患處涂1 mg/mL的LPS溶液1次，手術完成15 d后觀察大鼠牙齦退縮改變，明確牙齦退縮模型成功。

1.5 藥物干預方法

經病理驗證模型成功后，按組別設計分別進行藥物干預：大鼠頭部固定后，用開口器固定口腔，用修剪的兒童牙刷把凝膠反復涂抹患處，持續1 min，每日早晚2次，持續18 d，對照組和模型組用凝膠輔料進行干預。

1.6 牙齦退縮測量

每3 d用游標卡尺測量1次牙齦退縮變化，并觀察牙齦黏膜損傷后愈合情況。

1.7 Micro-CT掃描組織

18 d末，將大鼠麻醉后，用Micro-CT進行口腔牙齦掃描，掃描精度15μm，掃描結束后對大鼠牙齦組織進行測量分析。

1.8 病理HE染色和Masson染色

大鼠麻醉處死后，取部分大鼠牙齦組織浸入10%EDTA溶液中脫鈣，每3 d更換1次溶液，3周后梯度酒精脫水、石蠟包埋切片，4μm切片，按試劑盒說明書進行HE和Masson染色，觀察牙齦組織、黏膜、牙槽骨等病理改變。

1.9 牙齦組織TGF-β1、Krt5免疫組化染色

采用過氧化物酶標記的免疫組化法分別行TGF-β1、Krt5染色。免疫組化評分：染色結果采用半定量分析方法，以染色強度結合陽性細胞數百分比進行評分。染色強度以多數細胞呈現的染色強度并減去背景著色計分：無明顯著色為0分，輕微為1分，中度為2分，重度為3分。陽性細胞百分比：0%～5%評為0分，6%～25%評1分，26%～50%評2分，51%～75%評3分，＞75%均評為4分。最終評分為陽性細胞百分比得分與染色強度得分的和：0分為陰性，3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強陽性[8]。

1.10 Real-Time PCR檢測TGF-β1、Krt5基因表達

取部分牙齦組織，使用Trizol試劑（Invitrogen,U.S.A）提取總RNA。使用MMLV-reverse transcriptase（Fermentas，CAN）將其轉化為cDNA。用TGF-β1、Krt5引物進行擴增，通過將閾值周期（Ct）值歸一化，使用計算公式2-ΔΔCt計算出每個樣本中TGF-β1、Krt5的相對mRNA量?；蛞铮篢GF-β1 Sense primer：5’-CACCATCCATGACATGAACC-3’，Anti-sense primer：5’-TCATGTTGGACAAC TGCTC-3’；Krt5 Sense primer:5’-AGGGCACCAAGACCATAAAGCA-3’，Anti-sense primer：5’-TTCATGTAGGCCGCGTCCAC-3’；GAPDH Sense primer：5’-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3’，Anti-sense:primer:5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。

1.11 統計分析

采用SPSS 13.0軟件對數據進行分析，數據以mean±S.D.表示，差異性分析采用t檢驗或χ2檢驗，P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結果

2.1 Nif改善大鼠牙齦退縮

模型復制15 d后，Nif干預組分別用1 mg/mL和2 mg/mL濃度的Nif凝膠每天兩次干預牙齦退縮區域，18 d后，結果顯示，模型組牙齦退縮明顯，牙根裸露，而Nif干預組牙齦退縮明顯減輕（圖1.A，箭頭所示）。測量結果顯示：1 mg/mL自干預6 d起，2 mg/mL自干預3 d起顯示明顯的治療效果（與模型組對比，P＜0.01）（圖1.B）。

圖1 不同濃度的Nif對大鼠退縮程度的干預作用

2.2 Nif可以增加牙齦退縮模型組織含量

為研究牙齦退縮模型組織缺損的改變，采用Micro-CT檢測組織形態改變。結果顯示，模型組顯示組織明顯缺損（1.86±0.34 mm2），而1 mg/mL Nif（1.09±0.29 mm2）和2 mg/mL Nif（0.64±0.38 mm2）每天2次干預，18 d可以明顯增加牙齦組織含量，與模型組對比，牙齦組織明顯增加（P＜0.01）（圖2）。

圖2 Micro-CT分析大鼠牙齦組織缺損

2.3 Nif可以恢復退縮牙齦組織形態

為進一步分析Nif干預后牙齦退縮模型病理改變，用HE染色和Masson染色分析病理和膠原變化。HE染色結果顯示，與空白對照組對比，模型組上皮組織結構分層不清晰，表皮層和真皮層明顯變薄，顆粒層和棘層不明顯，皮下結締組織排列紊亂，組織厚度不足。Nif干預后可以明顯增加上皮角化層、顆粒層和棘層。2 mg/mL Nif組顯示其牙齦組織基本恢復正常。Masson染色結果顯示，對照組牙齦組織膠原纖維密集，排列整齊，纖維較長。模型組真皮組織纖維組織排列紊亂，表皮組織纖維缺乏。Nif干預后可以改善纖維排列，增加纖維含量，增加的纖維以表皮層組織為主（圖3）。

圖3 HE和Masson染色分析大鼠牙齦組織病理改變

2.4 Nif可以增加牙齦組織TGF-β1、Krt5的蛋白和基因表達

為進一步分析牙齦組織膠原纖維類型變化，通過免疫組化檢測TGF-β1、Krt5的蛋白改變，用RT-PCR檢測其mRNA改變。免疫結果顯示，與空白對照組比較，模型組缺損的牙齦上皮的角化層、顆粒層和棘層變薄，其TGF-β1、Krt5的蛋白表達較低。而Nif干預組的牙齦上皮角化層、顆粒層和棘層明顯增厚，蛋白表達明顯增加。而真皮層和皮下組織表達量差別不大。RT-PCR結果顯示，模型組TGF-β1、Krt5的mRNA表達降低，而Nif干預組可以增加mRNA的表達（圖4）。

圖4 通過免疫組化和Real-Time PCR檢測大鼠牙齦組織TGF-β1和Krt5的蛋白和基因改變

3 討論

牙齦退縮的原因比較復雜，如物理損傷、慢性牙周炎、年齡因素等[9]。本課題通過物理方法復制牙齦組織缺損，加LPS模擬炎癥刺激，成功復制了大鼠牙齦退縮模型。本研究初步證實了Nif對大鼠牙齦退縮模型的治療作用。

牙齦組織變薄和牙槽骨吸收是導致牙齦退縮的根本因素[10]。本研究中，與模型組對比，Nif可以增加牙齦組織含量，恢復缺損的牙齦組織，2 mg/mL Nif干預組牙齦形態基本恢復正常。說明Nif可以恢復退縮的牙齦組織。作為經典的鈣通道組織，Nif能夠升高牙齦上皮細胞內的游離鈣離子濃度，促進細胞的增殖，細胞內游離鈣離子濃度的升高可能是鈣離子拮抗劑誘導牙齦增生的機制[11]。本研究中，Nif明顯增加纖維組織含量，恢復牙齦上皮正常結構，尤其對牙齦上皮的顆粒層和棘層比較明顯。顆粒層和棘層是上皮中比較活躍的細胞層，通過分裂增殖修復損傷的牙齦上皮或組織，是維持牙齦正常形態和功能的主要細胞層[12]。本研究的結果提示，Nif對退縮模型的治療作用主要是通過恢復牙齦上皮顆粒層和棘層的活性來實現的。

TGF-β1可由多種細胞分泌，在調控細胞增殖和分化，在組織生長、修復及細胞外基質合成中發揮重要作用，TGF-β1在牙齦退縮的病理改變中也具有重要作用，通過TGF-β1可促進靶細胞增殖及膠原纖維的合成[13-14]。為進一步研究Nif對牙齦退縮的作用機制，我們檢測了TGF-β1的蛋白表達和基因表達，結果顯示，Nif可增加牙齦上皮細胞顆粒層和棘層細胞TGF-β1的表達。說明Nif增加上皮細胞TGF-β1的表達是促進牙齦組織修復的重要因素。

角化層對牙齦上皮具有保護作用，牙齦上皮細胞的正常角化也是其功能的重要表現[15]。細胞角蛋白是一組僅見于上皮細胞的中間絲成分,它們又能分為8種Ⅱ型（Krt 1～8）和12種Ⅰ型（Krt 9～20）角蛋白，Krt5是牙齦表皮角蛋白的一種，也是上皮細胞分裂能力和成熟的重要標志[16-17]。通過PCR和免疫組化檢測發現，Nif可以增加Krt5的表達，其主要分布在上皮細胞的角化層、顆粒層和棘層，說明Nif有可以促進牙齦上皮修復和成熟的功能。

本研究初步顯示，采用Nif持續進行局部干預，可以有效增加退縮的牙齦上皮細胞，恢復牙齦組織正常結構，該作用與促進上皮組織表皮細胞的分裂和增殖、促進上皮細胞角化成熟有關。提示Nif局部應用可以成為有效治療牙齦退縮的候選藥物。