微波輻射預處理提取細風輪菜總黃酮工藝及其含量的季節變化

雷 麗，陳旭波

（麗水學院生態學院，浙江麗水323000）

細風輪菜（Clinopodium gracile（Benth.）Matsum），又名塔花、剪刀草、瘦風輪等，為一年生唇形科風輪菜屬草本植物，主要分布于我國的廣東、福建、江蘇、廣西、云南等地[1]，資源十分豐富。細風輪菜作為中藥，全草入藥，有清熱解毒、活血功效，能治療感冒頭痛、中暑腹痛、乳腺炎、痢疾、蕁麻疹、嘔吐、毒蟲咬傷等[2]。

細風輪菜化學成分主要有黃酮類、皂苷類、揮發油、有機酸類、芳香族類、三萜類、甾體類等，其中皂苷類、黃酮類是該植物的主要活性成分[3-7]。研究表明這兩種活性成分具有抑菌、抗腫瘤[8-10]、治療心血管疾病[11-12]等功效。

活性成分的提取是應用的前提，近年來，微波輻射預處理提取在總黃酮提取工藝優化中的效果越來越顯著[13-14]。用該方法對細風輪菜三萜皂苷進行提取已有報道[8]，但對細風輪菜總黃酮進行提取并未涉及。另外，藥材的有效成分含量與采集時間密切相關，而細風輪菜生長周期較長，麗水本地全年可達10個月左右，而當地人偏向于隨時采用。因此，本實驗以細風輪菜為原料，采用微波輻射預處理提取細風輪菜總黃酮，研究微波輻射時間、微波功率、汽化劑用量、汽化劑浸潤時間、水浴溫度、乙醇體積分數、水浴提取時間、料液比等對總黃酮得率的影響，并通過正交試驗優化提取工藝。同時，探討總黃酮含量的季節變化，為細風輪菜的綜合利用提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本次實驗所用細風輪菜于2016年11、12月和2017年3、4月采自浙江省麗水市白云山，曬干粉碎后用石油醚預處理，風干備用。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

微波爐（Galanz，P70F20CN3P-SR（WO）型）；紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司，UV752）；循環水式多用真空泵（鞏義市瑞力儀器設備有限公司，SHZ-95B）；水浴鍋（上海珂淮儀器有限公司，Grant SUB AQUA 12 PLUS）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，ME104）；烘箱（上海精宏實驗設備有限公司，DHG-9246A）。

1.2.2 主要試劑

蘆丁（HPLC≥98%，北京世紀奧科生物技術有限公司）；石油醚（分析純，60-90，杭州高晶精細化工有限公司）；乙醇（分析純，杭州雙林化工試劑有限公司）；氫氧化鈉、硝酸鋁（分析純，天津市大茂化學試劑廠）；亞硝酸鈉（浙江省蘭溪市化工試劑廠）。

1.3 細風輪菜總黃酮的含量測定

1.3.1 總黃酮標準曲線的繪制

采用硝酸鋁顯色法[15]繪制總黃酮標準曲線。

1.3.2 微波輻射預處理

精確稱取細風輪菜5 g放入玻璃培養皿中，預處理過程參考王趙改[13]等人的方法。將預處理好的樣品放入燒杯中，加入一定濃度乙醇溶液，恒溫水浴提取，抽濾除渣，得黃酮提取液，待測。

1.3.3 總黃酮含量測定

將細風輪菜總黃酮提取液定容，用移液管取1 mL按照標準曲線測定方法進行顯色反應，最后定容至25 mL，測定吸光度，重復3次，取平均值。依據標準曲線方程，求得總黃酮得率。總黃酮得率（mg/g）=，其中X為稀釋倍數，Y為提取液體積，Z為提取液總黃酮濃度（mg/mL），W為粉末質量5 g。

1.4 單因素試驗

單因素實驗因素水平見表1，每個因素至少5個水平。

表1 單因素試驗

1.5 正交試驗

根據單因素試驗結果設計因素水平，對微波輻射時間（A）、微波功率（B）、汽化劑用量（C）、汽化劑浸潤時間（D）、水浴溫度（E）、乙醇體積分數（F）、水浴提取時間（G）、料液比（H）進行8因素3水平正交試驗，因素水平見表2，以細風輪菜總黃酮得率為評價指標，通過L27（38）正交試驗確定最佳提取條件，正交表參考表3。

表2 因素水平

1.6 數據處理

試驗數據均用Excel 2010和Minitab進行數據分析及圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線繪制

蘆丁標準曲線如圖1。線性回歸方程為Y=9.200 9X+0.008 6，R2=0.998 9，具有較好的相關性，表明蘆丁在0.2～1.2 mg范圍內呈線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素試驗結果

以總黃酮得率為縱坐標，各因素水平為橫坐標繪制單因素實驗折線圖（圖2～圖9），其中細風輪菜春季的總黃酮得率參考左邊（Y軸）的主坐標，冬季的參考右邊（Y軸）的次坐標。

圖2 微波輻射時間對總黃酮得率的影響

2.2.1 微波輻射時間對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 min，考察微波輻射時間30、60、90、120、150 s對總黃酮得率的影響。由圖2可知，隨著微波輻射時間的增加，細風輪菜總黃酮得率均先上升，當輻射時間為120 s時，冬季細風輪菜總黃酮得率最高，為45.823±0.315 mg/g；當輻射時間為90 s時，春季細風輪菜總黃酮得率最高，為223.203±1.052 mg/g，隨著微波輻射時間的增加，細風輪菜總黃酮得率均下降。

2.2.2 微波功率對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波輻射時間120 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 min、考察微波功率140、280、420、560、700 W對冬季細風輪菜總黃酮得率的影響。由圖3可知，隨著微波功率的增加，冬季細風輪菜總黃酮得率先上升，當功率為560 W時，冬季細風輪菜總黃酮得率最高，為45.823±0.315 mg/g。

圖3 微波功率對總黃酮得率的影響

汽化劑用量為2 mL、浸潤時間5 min、微波輻射時間90 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 min，考察微波功率對春季細風輪菜總黃酮得率的影響。由圖3可知，隨著微波功率的增加，春季細風輪菜總黃酮得率先上升后下降，當功率為560 W時，春季細風輪菜總黃酮得率最高，為223.203±1.052 mg/g。

隨著微波功率的增大，總黃酮得率均上升，表明需要足夠的微波能量破碎細胞結構，促使細風輪菜總黃酮進入溶劑，功率為560 W時，細風輪菜總黃酮得率最高，當微波功率達到700 W時，總黃酮得率均極顯著下降（P＜0.01（冬季）；P＜0.01（春季））。

2.2.3 汽化劑用量對總黃酮得率的影響

汽化劑浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間120 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 min，考察汽化劑用量0、2、4、8、16、24 mL對冬季細風輪菜總黃酮得率的影響，不同汽化劑用量下的總黃酮提取規律見圖4。當汽化劑用量為2 mL時，冬季細風輪菜總黃酮得率最高，為45.823±0.315 mg/g；當汽化劑用量為4 mL時黃酮得率最低，僅為39.981±0.307 mg/g。隨著汽化劑用量的增加，冬季細風輪菜總黃酮得率再次上升，當汽化劑用量為16 mL以上時冬季細風輪菜總黃酮得率趨于穩定。

圖4 汽化劑用量對總黃酮得率的影響

汽化劑浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間90 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 min，考察汽化劑用量對春季細風輪菜總黃酮得率的影響。由圖4可知，隨著汽化劑用量的增加，當汽化劑用量為2 mL時，春季細風輪菜總黃酮得率最高，為223.203±1.052 mg/g；當汽化劑用量超過2 mL時，春季細風輪菜總黃酮得率先下降后上升；在汽化劑用量為8 mL時，春季細風輪菜總黃酮得率下降至最低，為210.463±0.634 mg/g；當汽化劑用量為16 mL以上時春季細風輪菜總黃酮得率趨于穩定。

2.2.4 浸潤時間對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、微波功率560 W、微波輻射時間120 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 min，考察汽化劑浸潤時間0、5、10、20、40、60 min對冬季細風輪菜總黃酮得率的影響，不同浸潤時間下的總黃酮提取規律見圖5。當浸潤時間為5 min時，冬季細風輪菜總黃酮得率最高，為45.823±0.315 mg/g，隨著浸潤時間的增加，冬季細風輪菜總黃酮得率逐漸下降。

汽化劑用量2 mL、微波功率560 W、微波輻射時間90 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 min，考察汽化劑浸潤時間對春季細風輪菜總黃酮得率的影響。由圖5可知，當浸潤時間為5 min時，春季細風輪菜總黃酮得率最高，為223.203±1.052 mg/g，隨著浸潤時間的增加，春季細風輪菜總黃酮得率逐漸下降。

圖5 浸潤時間對總黃酮得率的影響

2.2.5 水浴溫度對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間120 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴提取時間30 mim，考察水浴溫度40、50、60、70、80、90℃對冬季細風輪菜總黃酮得率的影響。如圖6所示，隨著水浴溫度從40℃升高到80℃，總黃酮得率逐漸上升，當水浴溫度為80℃時，總黃酮得率為51.272±0.304 mg/g，隨后總黃酮得率趨于穩定，90℃時總黃酮得率下降不顯著（P＞0.05）。

圖6 水浴溫度對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間90 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴提取時間30 mim，考察水浴溫度對春季細風輪菜總黃酮得率的影響。如圖6所示，隨著溫度的上升，春季細風輪菜總黃酮得率先上升后下降，當水浴溫度為60℃時，總黃酮得率最高，為223.203±1.052 mg/g。

2.2.6 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間120 s、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度80℃、水浴提取時間30 mim，考察乙醇體積分數35、45、55、65、75、85、95%對冬季細風輪菜總黃酮得率的影響，見圖7。隨著乙醇體積分數增加，總黃酮得率先升高后降低，當乙醇體積分數為45%時，總黃酮得率最高，為52.857±0.662 mg/g。

圖7 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間90 s、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 mim，考察乙醇體積分數對春季細風輪菜總黃酮得率影響，見圖7。隨著乙醇體積分數增加，總黃酮得率先升高后降低，當乙醇體積分數為65%時，總黃酮得率最高，為223.203±1.052 mg/g。

2.2.7 水浴提取時間對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間120 s、乙醇體積分數45%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度80℃，考察水浴提取時間30、60、90、120、180 min對冬季細風輪菜總黃酮得率的影響，見圖8。隨著水浴時間的增加，總黃酮得率持續升高，在90 min時達到最高，為61.552±3.790 mg/g；水浴提取時間大于90 min之后，總黃酮得率開始下降。

圖8 水浴提取時間對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間90 s、乙醇體積分數65%、水浴提取固液比1:20 g/mL、水浴溫度60℃，考察水浴提取時間對春季細風輪菜總黃酮得率的影響，見圖8。春季細風輪菜總黃酮得率在30 min時最高，為223.203±1.052 mg/g，隨著水浴提取時間的變長，總黃酮得率呈下降趨勢。

2.2.8 料液比對總黃酮得率的影響

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間120 s、乙醇體積分數45%、水浴溫度80℃、水浴提取時間90 min，考察水浴提取固液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL對冬季細風輪菜總黃酮得率的影響，見圖9。由圖可知，當料液比從1:10 g/mL增加到1:40 g/mL時，冬季細風輪菜總黃酮得率逐漸增加；當料液比為1:40 g/mL時，總黃酮得率最高，為65.742±0.707 mg/g。

汽化劑用量2 mL、浸潤時間5 min、微波功率560 W、微波輻射時間90 s、乙醇體積分數65%、水浴溫度60℃、水浴提取時間30 min，考察水浴提取固液比對春季細風輪菜總黃酮得率的影響，見圖9。由圖可知，當料液比從1:10 g/mL增加到1:40 g/mL時，細風輪菜總黃酮得率逐漸增加；當料液比為1:40 g/mL時，總黃酮得率最高，為227.731±0.384 mg/g。

圖9 料液比對總黃酮得率的影響

2.3 正交試驗結果及驗證實驗

以春季細風輪菜為材料，進行正交實驗，正交試驗結果如表3所示，通過正交實驗結果極差分析可知，影響細風輪菜總黃酮得率的因素順序為：乙醇體積分數＞水浴溫度＞汽化劑浸潤時間＞水浴時間＞料液比＞微波功率＞微波輻射時間＞汽化劑用量。表4顯示乙醇體積和水浴溫度對春季細風輪菜總黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01），汽化劑浸潤時間對春季細風輪菜總黃酮的提取率影響顯著（P＜0.05），與極差分析提示的主導因素保持一致。綜合極差和方差分析得出最佳組合為A2B1C2D1E3F1G3H3，即春季細風輪菜總黃酮的最佳提取條件為微波輻射時間90 s、微波功率420 W、汽化劑用量2 mL、浸潤時間0 min、水浴溫度70℃、乙醇體積分數55%、水浴提取時間90 min、水浴提取固液比1:50 g/mL。在正交試驗最佳條件下，春季細風輪菜總黃酮得率為239.300±0.725 mg/g，顯著高于正交試驗的所有組別（P＜0.05）。

表3 續表

表3 L27（38）正交試驗結果

表4 方差分析

2.4 不同方法提取細風輪菜總黃酮工藝的比較

如表5所示，在正交試驗方法最佳條件下，春季細風輪菜總黃酮得率為239.300±0.725 mg/g，傳統乙醇提取春季細風輪菜總黃酮得率為227.671±0.286 mg/g，兩種提取方法對細風輪菜總黃酮得率差異極顯著（P＜0.01）；在單因素試驗方法最佳條件下，微波輔助提取冬季細風輪菜總黃酮得率為65.742±0.707 mg/g，傳統乙醇提取春冬季細風輪菜總黃酮得率為61.999±0.226 mg/g，兩種提取方法對冬季細風輪菜總黃酮得率差異顯著（P＜0.01）。

表5 不同提取方法結果比對

3 討論與結論

微波輻射預處理對植物細胞壁產生了破壞作用，幾乎無完整細胞存在。細胞壁破壞嚴重，這就提高了后續提取的效率，逐漸成為一種理想的植物活性物質提取方法[8,13]。本實驗結果表明，微波輻射預處理前后總黃酮得率發生了極顯著的改變，進一步驗證了微波輻射預處理可以提高活性物質的提取率。

總黃酮得率和各個單因素水平有著密切的關聯，由于微波輻射時間過長和微波功率過高，實驗中總黃酮得率均出現下降，可能是溫度過高導致樣品中總黃酮被破壞[16-17]。總黃酮得率在汽化劑用量為2 mL時最高，隨著汽化劑用量的增加使得提取體系增大，即粉末受到的微波處理相對減弱，總黃酮得率下降。接著，隨著汽化劑用量繼續增加，黃酮溶出動力加大，且這種增大的趨勢逆轉了微波能量被分擔的影響，所以黃酮得率有所回升[18]。由結果可知，溫度升高有利于黃酮的提取，但溫度過高可能會破環黃酮結構，另一方面溫度過高會造成溶劑的損失，因此造成總黃酮得率的下降[19]。實驗中隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮得率先上升后下降，可能由于乙醇體積分數越高，對氫鍵的斷裂作用越強，提取率越高；但當乙醇體積分數過高時，產生了較大滲透壓，破壞了黃酮結構，另一方面，部分醇溶性有機物質溶解增加，影響總黃酮提取濃度，導致其提取率下降[18,20-21]。延長水浴時間有利于黃酮的提取，但時間過長總黃酮得率下降，一方面與黃酮長時間處于高溫狀態而被破壞有關；另一方面高溫使蛋白質凝固，黃酮不易溶出，同時高分子雜質浸出增加，影響提取物有效含量[22]。實驗結果表明，當料液比超過1:40 g/mL時，總黃酮得率下降，這可能是因為乙醇用量過大會增加熱負荷，延長了提取時間[23]。

在單因素實驗中，不同季節的材料在微波輻射時間和水浴時間這兩個因素中表現出了一定的差異。春季材料所需的最佳微波輻射時間和水浴時間均低于冬季材料，這是否與材料總黃酮含量的高低有關，還需進一步驗證。

通過試驗表明，細風輪菜總黃酮的含量隨著季節的變化而變化，春季細風輪菜總黃酮含量明顯高于冬季細風輪菜總黃酮含量，春季的最大值達到冬季的5倍左右。這與李瑞雪等[24]研究桑樹總黃酮含量變化規律基本一致，不同季節桑葉的總黃酮含量以春季最高。研究結論可以為細風輪菜作為藥材收獲提供參考，但是，其他活性物質成分積累的變化規律以及活性大小是否與季節變化有關需要進一步確認。