上部掛灰煙葉形成與蠟質層的關系研究進展

孫皓月 史洪濤 顧會戰 謝良文

摘? ? 要：角質蠟質是植物在長期抗性生理過程中形成的次生代謝產物，也是導致上部葉掛灰，煙葉可用性降低的重要原因。為保障煙葉原料水平和經濟效益，解決上部葉掛灰問題成為一種必然需求。本研究報告了目前國內外上部葉掛灰煙形成機理、原因分析及蠟質層對其影響的研究現狀，結合生產實際在已有研究文獻的基礎上總結出蠟質層厚度含量、化學組分、結構對煙葉掛灰造成的影響進行歸納總結。為調整烘烤工藝、揭示煙葉蠟質層調控機制、培育不易掛灰新品種提供參考。

關鍵詞：上部葉;掛灰煙葉;蠟質層

中圖分類號：S572? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.10.015

Research Progress on the Relationship? between the Formation of? Upper Browning Tobacco Leaves and the Wax

SUN Haoyue1， SHI Hongtao2， GU Huizhan2， XIE Liangwen3

（1.Henan Agricultural University， Zhengzhou，Henan 450000，China; 2.Guangyuan Tobacco Company of Sichuan Province，Guangyuan，

Sichuan 628000， China; 3. Sichuan Branch of China National Tobacco Company， Chengdu， Sichuan 610000， China）

Abstract： As a secondary metabolite generated by plants in the long-term resistance physiological process， cutin wax was considered an important factor in causing the browning on upper leaves and reducing usability of tobacco leaves. In order to guarantee the quality level and economic benefits of tobacco raw materials， it has become an inevitable demand to solve the problem of the browning on the upper tobacco leaves. This study reviewed the current status of domestic and foreign research on the formation mechanism， cause analysis， and the influence of waxy layer on the upper leaf browning. Then， combined with the actual production， based on the existing research literature， it summarized the influence of the thickness， content， chemical composition and structure of the waxy layer on the formation of the browning on tobacco leaves. The study aimed to provide references for adjusting the curing process， discovering the regulation mechanism of the waxy layer of tobacco leaves， and cultivating new varieties that are not prone to be browned.

Key words： upper leaves; browning tobacco; wax

上部葉占烤煙整株的1/3，其質量影響著烤煙總體產量。由于上部葉濃度厚實飽滿，香氣濃郁，為卷煙產品增質提香，改善吃味，對凸顯與鞏固卷煙牌號香型和品質起著非常重要的作用[1]。但我國上部葉生產中存在的問題較多，葉片組織密而厚，成熟慢，主要體現在青、雜、僵，尤其是上部葉雜色（以掛灰煙為主）和葉片僵硬等問題仍未得到有效地解決。目前，我國上部葉質量和可用性發展受到限制，與國外卷煙配方中上部煙葉占到整個煙葉使用率高達40%的比例相差較大[2]。

掛灰煙一直是煙葉烘烤的研究重點。在實際生產中，由褐變反應而導致的煙葉掛灰是制約煙葉可用性的重要原因之一[3]，同時煙葉顏色是煙草外觀質量評價的重要指標，也是煙葉分級、煙葉評價標準、打葉配方質量控制等方面的重要依據。從國內烤煙生產一線研究人員發表的科技論文來看，掛灰煙的形成機制比較復雜，既與栽培條件有關，也受煙葉烘烤過程影響，具體表現為地域環境條件和微環境的變換;異常氣候變化;烤煙品種和葉片著生部位的不同，尤其是上部葉最容易掛灰;栽培條件和煙農種植習慣的差異;煙葉成熟狀態和編裝煙的差異;烘烤工作人員對烘烤工藝和烘烤設施設備的熟悉掌握程度等。總的來說，這些復雜因素糅合在一起，導致對掛灰煙認識不足，發生機理不明，試驗重復困難，更難以提出系統的掛灰煙消減技術與對策，指導生產困難。因此，有待對上部葉掛灰問題進行深入、系統的研究。

1 掛灰煙形成的機理

烘烤過程中由于褐變的發生導致煙葉正表面出現局部或全部的灰色、深褐色斑點，稱之為掛灰。褐變是普遍存在的一種變色現象，在對食品、植物加工或貯藏的過程中，細胞不可避免受到損傷，酚類物質發生氧化，色澤變暗，這些顏色變化都屬于褐變[4]。褐變按其發生的機理可分為酶促褐變與非酶促褐變。

1.1 煙葉的酶促褐變

在1883年Yoghid發現某種活性物質可以使漆樹汁變硬后，由Betrand首次研究出這是一種酶蛋白，并在40年后由Keilind等研究出多酚氧化酶的分離過程，為酶促棕色化反應的研究打下基礎[5]。酶促棕色化反應是綠色植物細胞的一種正常生理生化反應， 對提高植物抗性、調節光合作用等方面具有積極作用[6]。酶作為植物細胞中呼吸作用的轉遞介質，維持醌類與酚類化合物的動態平衡，當這種動態平衡被打破，酚類物質迅速轉變成大量醌，醌的聚化或結合成黑褐色聚合物造成了褐變現象。由于多酚氧化酶、多酚類底物、氧3個條件同時具備才可能發生酶促褐變反應，所以一般發生在含有活性酶的組織或鮮活的植物組織中[7]。煙葉內富含多種酚類物質和多酚氧化酶，在調制、烘烤、陳化等加工過程中，內部酚、醌含量由于多酚氧化酶的作用下導致其失衡，煙葉外觀呈現褐色細小斑塊，如同蒙上一層灰一樣，通常先出現在葉尖或葉基部。在烘烤過程中由于氣候、成熟度、病害、烘烤工藝不完善等因素等造成煙葉掛灰等問題通常出現在煙葉變黃末期和定色期，變黃期煙葉變黃與失水不協調，定色期溫度驟升驟降都易造成煙葉掛灰。煙葉中多酚類物質持續被氧化，氧化還原失衡，被氧化成的醌類物質聚合產生黑色沉淀[8]。此時由于煙葉內含物質的不斷消耗，導致葉片變薄，重量減輕，煙葉柔韌性變差，光澤不鮮亮，煙葉底色微灰，質量下降。

1.2 煙葉的非酶促褐變

在植物、食品加工與貯存過程中，常發生與酶無關的褐變，稱為非酶促褐變。非酶促褐變包括美拉德反應、抗壞血酸氧化分解、多元酚氧化縮合反應、焦糖化反應及金屬離子引起的褐變等[10]。在煙葉的調制、發酵、醇化等加工過程中非酶促棕色化反應均有發生，均為美拉德反應。美拉德反應是煙草特征香味形成的主要來源之一，對煙草中美拉德反應的研究最早可追溯到20世紀末[11]。目前，美拉德反應機理以Hoge提出的初級階段、高級階段、終級階段三階段分類最為經典[12-13]。糖類和氨基酸縮合環化，經過海因式重排與阿馬杜里重排形成阿馬杜里中間產物，在不同pH值條件下發生，經過斯特雷科爾降解、分子脫氫、異構化等一系列復雜反應，最終形成黑色的大分子物質，稱為類黑素[14-16]。在煙葉調制階段，大分子物質的不斷降解導致美拉德反應產物含量大量積累，且呈動態變化，其產物可以賦予煙葉特殊的香味，提升煙葉柔和度，改善煙氣吃味。

2 上部葉掛灰的原因分析

根據國內外關于掛灰煙的研究和烘烤實踐中的研究發現，煙葉以上部葉最易掛灰。一般來說上部煙葉片較厚，干物質積累多，束縛水含量高，葉綠素含量高，多酚類物質多，多酚氧化酶活性高，這些因素是上部煙難烤的物質基礎，而且上部煙在田間時間長，易受到氣候影響與病害的影響，遇到冷氣候，形成“冷害煙葉”;遇到降水，形成“返青煙葉”;病害容易發生;形成“病害煙葉”;以上外因均是上部煙成為烘烤中“問題煙”的外部因素。

2.1 鮮煙葉素質是影響上部煙葉掛灰的首要因素

黑暴煙葉：韓錦峰等[17]研究發現黑暴煙含水量高，成熟時落黃差，田間鮮煙葉的多酚氧化酶活性較高，同時在烘烤過程的定色中后期失水率低，且多酚氧化酶依舊保持高活性并最終形成掛灰。也有研究發現黑暴煙在烘烤過程中前72 h含水率普遍偏高，葉片失水困難，且PPO活性顯著高于正常煙葉，烘烤過程中極易變褐掛灰[18]。

冷害煙葉：張樹堂[19]總結出在煙葉成熟期時氣溫下降使煙葉受冷害，煙葉內含物質轉換被擾亂而產生田間“冷掛灰”。這是高海拔煙區上部煙葉產生灰色煙的主要原因，特別是9月中旬以后采收的煙葉，由于溫度降低極易產生“冷掛灰”。在緯度高的煙區，影響更為明顯。鄒陽等[20]研究發現高海拔低氣溫導致煙葉在田間成熟度較低，成熟期推遲干物質積累減少，烘烤后期常出現嚴重掛灰和青黃煙。四川煙草所在近年的研究中也發現，四川高海拔地區廣元和涼山，在9月份后，由于溫度下降較快，上部葉掛灰現象嚴重，這和云南院的結果相一致。

過熟煙葉：何偉等[21]研究發現一旦煙葉過熟，在田間或者烤房過多地消耗葉片內部的營養物質，導致葉片的細胞間隙增大，組織疏松，如果變黃期稍長，容易造成“饑餓掛灰”。

未熟煙葉：未熟煙葉含水量高，導致烘烤過程中變黃末期至定色PPO活性增高，煙葉由于組織結構緊密變黃中后期失水速度較慢，多酚氧化酶的高活性導致未熟煙葉的烤后煙掛灰率明顯高于成熟煙葉[22]。

病害煙葉：據部分煙區反映，染病烤煙，如根結線蟲輕微發生的狀態，即使鮮煙葉看不出癥狀，烘烤過程中可出現斑點狀的掛灰現象，這與病害破壞煙葉細胞組織結構緊密相關。一般情況下開片好，大田抗病性較強病害發生情況較少的上部葉，掛灰程度也明顯減輕[23-24]。

機械損傷煙葉：在加工過程中機械損傷破壞了膜的完整性， 促進了植物細胞的膜脂過氧化作用，導致H2O2等活性氧大量積累，破壞了細胞內活性氧的平衡，膜脂過氧化作用中的最主要產物MDA積累加速了植物的褐變[25]。采收與運輸過程中，如果磨傷擦傷煙葉，造成機械損傷。損傷部分煙葉的細胞組織就會破裂，呼吸速率升高，膜脂過氧化造成多酚類物質流出，烘烤過程易造成掛灰雜色。

2.2 烘烤環節中葉片的水分散失和掛灰關系密切

主要體現在黃干不協調上，呂作新等[9]研究發現關鍵期的葉片含水量與煙葉掛灰問題緊密相關，指出煙葉進入干葉中后期時，葉片的脫水率一般不低于鮮煙葉飽和含水量的30%，如果沒達到這一標準，干球溫度超過46 ℃的話，可以在短時間形成掛灰。旱天煙葉的水分含量較少，束縛水比例相對增高，自由水比例降低，煙葉組織結構緊密，烘烤時易出現回青或掛灰[26]。尤其是上部葉，蠟質較多，氣孔窄小，煙葉烘烤過程中排濕困難，煙葉支脈變黃順利，但失水程度達不到勾尖卷邊狀態，即黃干不協調，失水達不到要求，此時快速升溫易產生掛灰煙[27]。在煙葉烘烤過程中，不同成熟度煙葉水分含量的不同造成多酚氧化酶活性、多酚類物質積累規律的不同影響著煙葉在變黃末期到定色前期酶促棕色化反應[28]。一方面，也體現在裝煙上，如果上部煙裝煙量過大，水分難脫，掛灰煙葉時常出現[29]。近年來，在前期的研究中也發現，在烘烤過程中，當采摘的上部葉失水速度較慢，更容易形成掛灰煙。因此，葉片失水速率是影響掛灰煙形成的最重要因素之一。

3 蠟質層是影響上部葉掛灰的主要原因

覆蓋于植物地上器官，用于抵御干旱、高溫低溫、病蟲害等的保護屏障被稱為角質膜。 植物角質膜從結構可分為3部分， 蠟質層位于最外層，由鑲嵌于角質層內部的內層蠟質和覆蓋于角質層外部的表皮蠟質組成，占整個角質膜的10%。植物蠟質的合成和運輸需要不同細胞器和多種酶復合體的共同參與，是一個非常復雜的過程[30]。關于植物蠟質層的生物合成機制已有較完善的研究，主要集中在模式植物擬南芥上。研究表明，植物表皮蠟質的合成主要通過脫羰基化和酰基還原途徑將超長鏈脂肪酸合成各種蠟質組分，這些蠟質組分通過ABC轉運蛋白家族的活性蛋白由質膜輸出至細胞外基質，釋放蠟質化合物[31]。此外，徐靜等[32]的研究表明溫度、光照和水分等環境因子的變化在很大程度上會影響到植物表皮蠟質合成的生物過程，進而影響蠟質層各組分的含量與分布。

為更好適應陸地生活，表皮蠟質覆蓋于所有陸生植物地上部分各器官和組織表面，介于自然環境與生物環境之間，是植物組織與外界自然環境的第一接觸面，為植物適應環境、抵抗各種生物與非生物脅迫、進行自我防護提供重要保障[33]。由多種疏水有機物混合組成與疏水結構的保護層覆蓋，形成了植物表皮蠟質，其最基本生理功能就是防止體內水分的非氣孔性散失，以降低水分的蒸騰作用[34]。一般認為，表皮蠟質的含量與厚度會影響到植物的水分蒸騰，植物的蠟質含量高其耐旱能力也較強。葉小利等[35]對大豆的研究發現，在受到水分脅迫時，葉片表皮蠟質含量較高的品種，其表皮蒸騰速率也保持在相對較低水平;Premachandra等[36]對玉米葉片的研究表明，植物耐旱能力通常與其葉片表皮蠟質含量成正比;在張海祿等[37]的研究中，抗旱大麥品種葉片表皮的蠟質含量在其受干旱脅迫初期變化明顯，推測表皮蠟質含量的迅速增加可能是植物為抵抗干旱而進行自身調節的重要表現。這些結果都表明葉片蠟質層的含量和厚度可能影響葉片水分的散失，從而調控植物的耐旱能力。目前，人們對于植物表皮蠟質層保水性能的研究不僅從表皮蠟質的厚薄程度與含量方面，蠟質組分與結構也起到了重要作用。

角質蠟質在植物長期的生態適應過程中，不僅在抗旱保水中具有重要的生態學功能，其組成成分與結構在植物逆境抵御、病蟲害防衛等抵御惡劣生態環境及生物非生物脅迫中也起著關鍵性作用[38-39]。植物角質層蠟質主要包括脂肪族化合物和環狀化合物，脂肪族化合物主要由長鏈（大于C18）脂肪酸、超長鏈（C24～C36）脂肪酸、烷烴類、酯類、醇類、醛類、酮類等一系列疏水性物質組成;環狀化合物包括酚類、酯類、黃酮類等。其化學組成復雜，且其組分含量、形態結構隨生育時期變化而有所差異[40-41]。角質蠟質能夠有效阻止植物中水分非氣孔性散失，其保水性功能的主導因素比較復雜。不僅與蠟質含量與厚度有關，蠟質的組成成分與結構也具有決定性作用。有研究表明蠟質中烷烴類物質與葉片保水性密切相關，在限制水分蒸騰上扮演重要角色[42]。Gerd V等[43]的研究發現，番茄果實中蠟質的化學成分對表皮水分散失程度起決定性作用，蠟質中脂肪族化合物是防止水分蒸騰的重要影響因素，而三萜類化合物等環狀組分的保水性能相對較弱;Oliveira等[44]通過對比發現兩地區植被中，蠟質的化學組分是決定蒸發阻力程度的一個重要因素。

作為植物面對環境的“第一保護層”，蠟質層會通過改變自身晶體結構形態與化學組分構建防御機制以減輕外界不利環境因子的脅迫。在煙草的表皮蠟質層組成成分中烷烴類物質占主導地位，初級醇與三萜類化合物含量較少，與果蔬等片狀、小棒狀、線狀、管狀等結構不同，煙葉上下表皮蠟質呈無裂紋、無晶體狀且較平滑的薄膜狀[33]。上部葉中蠟質含量較多，在烘烤過程中由于內部多酚類物質氧化成醌類物質，易出現淺灰色、灰褐色的褐變斑點，出現掛灰現象。煙葉在烘烤過程中隨著溫度的升高，蠟質的分泌不斷增多，蠟質結構改變表面褶皺聚積[45]。Cgjuste等[46]發現，通過乙烯處理增加果實表皮蠟質層含量，并引起表皮蠟質形態變化，果實表皮蠟質形態結構的改變有助于減少非冷害果皮的褐斑。李生娥等[47]通過對蘋果梨研究發現，使用HWD處理后果實表皮蠟質溶化，減少了網狀裂紋的蠟質結構，降低組織中的通氧量來延緩了蘋果梨的成熟和衰老，并減少表皮褐變現象。在儲存過程中，蠟質層結構的改變影響著果皮的褐變面積[48]，套袋處理可以降低蠟質含量，改變蠟質結構，影響果實抗逆性與褐變程度[49]。另外，套袋與否對蠟質的化學組分種類和鏈長有明顯的影響，經套袋處理的果實表皮蠟質C30飽和鏈烷酸豐度明顯減少，從而改變果實衰老進程[50]。可見蠟質層不僅能夠通過非氣孔性散失影響植物的褐變與衰老，化學組分與結構也參與了植物的防御反應。

隨著分子生物學的發展，人們對植物角質蠟質對褐變影響的認知也不斷深入。有研究發現褐變處理后的茶樹新梢組織，物理防御可能被激活，通過滲透調節角質蠟質以抵御逆境脅迫[51]。關于改善上部葉掛灰的研究，主要涉及烤煙品種、成熟度、采收方式、烘烤工藝等方面，從蠟質層方面研究仍然很不完善。至今關于烤煙蠟質層的研究多基于烤煙蠟質層本身結構、成分的研究，對于改善烤煙蠟質層來調控煙葉失水特性以及蠟質層化學組分和結構對掛灰影響的研究還未見報道。而在實際烘烤生產過程中，蠟質層嚴重阻礙了煙葉變黃與失水協調性，單從烘烤工藝、烤房環境等方面進行探索研究并不能改善煙葉本身的失水特性。

4 結 語

綜上所述，雖然國內外已對掛灰形成機理和技術進行了探索，對掛灰煙的“酶促棕色化反應”進行了豐富的研究，并結合實際生產中遇到的情況進行了解釋，但鑒于生產中掛灰煙形成原因的復雜性，葉片蠟質層含量、化學組分與結構怎樣影響煙葉的失水速率，導致葉片掛灰的理論方面還缺乏深入系統的研究。因此，筆者認為應加強以下3個方面的研究。

（1）加強烤煙表皮蠟質層的組成成分、厚度與形態結構方面的研究，明確蠟質層影響煙葉失水特性途徑、方式，探究蠟質層與烘烤特性的關系，為調整烘烤工藝打下基礎。

（2）一方面加強成熟期蠟質層的變化規律及其影響因素的研究，蠟質通過應對干旱、溫度等多種非生物脅迫來適應環境的變化。探明環境因子對蠟質層形成的影響，明確主效因。例如，四川涼山煙區，海拔較高，上部葉發育后期溫度的降低是影響葉片蠟質層形成的主要因素;另一方面，探索采后煙葉蠟質層變化規律與溫度和時間的關系，為烤煙后熟技術提供理論參考。

（3）開展對煙葉表皮蠟質層合成調控機制的研究。不同品種植物蠟質層轉錄途徑也不相同，目前在擬南芥、水稻、水果等植物中角質蠟質物理抗性與化學抗性作用已有較完善研究，但煙草中哪些蠟質組分誘導提高了煙葉的抗性，哪些轉錄因子參與了煙葉蠟質代謝調控，其作用機制仍未完全闡明，僅僅研究這些蠟質基因的調控是不夠的。因此，需要認識到蠟質合成的復雜性，尋找篩選其調控因子，隨著現代分子技術手段的發展和蠟質相關基因的克隆，利用瞬時表達和轉基因技術研究果實蠟質合成關鍵基因的功能，進一步揭示這些基因對果實表皮蠟質合成的調控機制，從而培育出不易掛灰的烤煙新品種，對未來農業生產具有深遠的科學意義和應用前景。

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