免疫親和柱-液質聯用法測定餅干中赭曲霉毒素A的含量

孫小杰 王玉梅 劉真 姜星

摘 要：目的：建立免疫親和柱-液質聯用法測定餅干中赭曲霉毒素A的分析方法。方法：樣品經80%甲醇水溶液提取，提取液經免疫親和柱凈化，并聯合液質聯用法對餅干中的赭曲霉毒素A進行測定。結果：赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，線性相關系數大于0.99，方法的定量限為1.0 ?g/kg。樣品的加標回收率為89.61%～105.7%，測定結果的相對標準偏差均小于7.26%（n=6）。結論：該方法具有快速，定量準確，線性相關性理想，可適用于餅干中赭曲霉毒素A的測定。

關鍵詞：液質聯用;免疫親和柱;赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素是真菌毒素之一，是由純綠青霉、赭曲霉及碳黑曲霉等產毒菌株污染糧食、食品、飼料及其他農副產品后所產生的一種有毒代謝產物，有A、B、C、D4種化合物，其中毒性最大的是赭曲霉毒素A[1]。赭曲霉毒素A對動物和人的毒性主要有腎臟毒、肝毒、致畸、致癌、致突變和免疫抑制作用[2]。為了保障人們的身體健康，《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規定了谷物及其制品中赭曲霉毒素A的限量為5.0 ?g/kg[3]。

2021年4月，歐盟食品和飼料快速預警系統通報出口至我國的薄脆餅干中赭曲霉毒素A含量不合格，目前文獻報道的赭曲霉毒素A的測定方法主要涉及糧食及其制品、咖啡、酒[4-6]，針對餅干中赭曲霉毒素A測定技術的研究較少。因此有必要建立餅干中赭曲霉毒素A的方法，為餅干中赭曲霉毒素A的含量測定提供技術支撐。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-串聯質譜儀：Agilent 1260 HPLC-6470型，配有電噴霧離子源，美國 Agilent公司;電子天平：XS205型，瑞士Metler-Toledo公司;固相萃取裝置：Wat200609，美國Waters公司;免疫親和柱：3 mL，青島普瑞邦生物工程有限公司;氮吹儀：N-EVAP，美國Organomation公司;離心機：ROTINA 35，德國Hettich公司。

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純，美國ROE公司;甲酸銨、冰乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、吐溫20：分析純，國藥集團化學試劑有限公司;赭曲霉毒素標準物質：上海安譜實驗科技股份有限公司;實驗室用水為經Mili-Q凈化系統（0.22 ?m過濾膜）過濾的超純水;真菌毒素清洗緩沖液：先將12.5 g氯化鈉、2.5 g碳酸氫鈉溶于約250 mL水中，加入0.05 mL吐溫20，用水定容至500 mL;磷酸鹽緩沖液：先將4.0 g氯化鈉、0.6 g磷酸氫鈉、0.1 g磷酸二氫鉀、0.1 g氯化鉀溶于約490 mL水中，用濃鹽酸調節pH至7.0，用水定容至500 mL。

1.2 標準溶液的配制

（1）赭曲霉毒素A標準儲備液。稱取赭曲霉毒素A標準品1.0 mg，用乙腈-甲醇溶液（50+50）溶解并定容至

100 mL，配成10 ?g/mL的標準儲備液，-20 ℃保存。

（2）赭曲霉毒素A標準工作液。準確移取一定量的赭曲霉毒素A標準儲備液，用空白樣品提取液稀釋，分別配成0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的基質標準工作溶液，4 ℃保存。

1.3 色譜-質譜條件

色譜柱：Eclipse plus-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 ?m，美國agilent公司）;柱溫30 ℃;流速：0.2 mL/min;進樣量：20 ?L;流動相：A為5 mmol/L甲酸銨水溶液（含有0.1%甲酸），B為95%乙腈水溶液（含有0.1%甲酸）;梯度洗脫程序為：0～2 min，35%～95% B;2～7 min，95% B;7～

7.1 min，95%～35% B;7.1～12min，35% B。

1.4 樣品處理

1.4.1 樣品提取

稱取粉碎均勻的試樣25.0 g，加入100 mL甲醇-水溶液（80+20），高速均質5 min后用定量濾紙過濾，準確移取4 mL濾液于離心管中，加入26 mL磷酸鹽緩沖液后混勻，混合液備用。

1.4.2 樣品凈化

將免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下，將混合液分兩次注入玻璃注射器中。調節流速約1 滴/s，直至空氣進入親和柱中，依次用真菌毒素清洗緩沖液10 mL、水10 mL連續淋洗親和柱，調節流速1～2 滴/s，棄去全部流出液，抽干親和柱。加入1.5 mL甲醇，調節流速約為1 滴/s，用試管收集全部洗脫液，在45 ℃下水浴，氮氣吹干，用500 ?L

流動相溶解，供檢測用。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

以甲醇-水溶液（80+20）與乙腈-水溶液（60+40）作為提取溶劑，結果發現兩種提取溶劑的回收率都能達到90%以上，但考慮到乙腈的毒性，選擇甲醇-水溶液（80+20）作為提取溶劑。

2.2 基質效應、線性方程與定量限

采用基質標準溶液曲線與溶劑標準溶液曲線的斜率比來評價基質效應，斜率比為11.9，餅干基質對赭曲霉毒素A具有基質增強效應，因此采用基質標準溶液對赭曲霉毒素A進行定量分析。赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL濃度范圍內，標準溶液的質量濃度x與色譜峰面積y呈良好的線性關系（r≥0.992 3），線性方程為y=7 166.18x-474.81，以信噪比為S/N≥10時確定定量限為1.0 ?g/kg，歐盟規定餅干中赭曲霉毒素A限量值為3.0 ?g/kg，因此，方法定量限滿足檢測的需求。

2.3 方法回收率與精密度試驗

通過向陰性樣品中添加1.0 ?g/kg、3.0 ?g/kg、10.0 ?g/kg

3個濃度水平的赭曲霉毒素A標準溶液，進行方法回收率和精密度試驗，測定結果見表1。由表1可知，赭曲霉毒素A的回收率在89.61%～105.7%，相對標準偏差為3.69%～7.26%，符合GB/T 27404—2008中檢測方法確認的要求。

3 結論

對餅干進行前處理，然后采用液質聯用法對赭曲霉毒素A進行測定，從而建立了餅干中赭曲霉毒素A測定的檢測方法。本方法簡便準確，實用性強，可為餅干中赭曲霉毒素A風險監測提供可靠的技術支持。

參考文獻

[1]PETZINGER E，ZIEGLER K.Ochratoxin A from a toxicological perspective[J].Journal of Veterinary Pharmacology Therapeutics，2010，23（2）：91?98.

[2]REDDY L，BHOOLA K.Ochratoxins-food contaminants： impact on human health[J].Toxins，2010，2（4）：771-779.

[3]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.

[4]呂相征，謝妮，李業鵬，等.用高效液相色譜法測定糧食樣品中的赭曲霉毒素A[J].中國醫科大學學報，2002（4）：47-48.

[5]樊祥，禇慶華，周瑤，等.液-液萃取結合免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜測定烘焙咖啡中赭曲霉毒素A[J].理化檢驗（化學分冊），2008（8）：736-739.

[6]楊超，林洪，張輝珍，等.免疫親合柱凈化高效液相色譜檢測啤酒中赭曲霉毒素A[J].食品與發酵工業，2007（12）：

127-129.