TNF-α通過調控miR-363-3p/EZH2促進肺癌細胞增殖、遷移與侵襲

張琳琳 陳影 滕膈玲 楊燕 魏敏 胡華

(山東省胸科醫院呼吸科，山東 濟南 250013)

肺癌的死亡率和發病率在惡性腫瘤排行榜均居首位〔1,2〕。近年，肺癌在中國的發病率明顯呈增加趨勢。盡管醫療水平和新藥均不斷發展，使肺癌的預后得到改善，但晚期肺癌的預后及總生存率仍處于較低的水平。因此，提高肺癌的早期診斷及預后率具有重要意義。腫瘤壞死因子(TNF)-α為TNF的成員之一，其常作為免疫因子或炎性因子在實驗及臨床上應用〔3〕。TNF-α也參與調控腫瘤的發生發展，如其可可誘導增殖特異性轉錄因子FoxM1表達，通過調節FoxM1/活性氧/低氧誘導性因子(HIF)-1途徑導致肝癌細胞增殖及凋亡抑制〔4〕。但TNF-α在肺癌中的作用及機制研究甚少。miRNA是在轉錄及轉錄后水平調控基因表達的單鏈、長度在19～25 nt的小分子RNA〔5〕。miR-363-3p已被證實在多種癌癥中發揮功能，但其在肺癌中miR-363-3p的作用機制尚未完全闡明。組蛋白甲基轉移酶(EZH2)為組蛋白甲基轉移酶，為多梳基因蛋白家族的關鍵成員〔6〕。大量研究證實，EZH2在癌組織中表達異常升高，且與癌癥的惡性程度呈正相關〔7〕。但EZH2在肺癌中與miR-363-3p和TNF-α的作用關系尚未見報道。本研究著重分析TNF-α對肺癌細胞生物學行為的影響，揭示其機制與miR-363-3p/EZH2通路的關系。

1 材料與方法

1.1材料 人肺癌細胞A549購自ATCC；EZH2兔抗人單克隆抗體、TNF-α兔抗人單克隆抗體購自Abcam公司；免疫組織化學試劑購自北京中杉公司；LipofectamineTM2000、逆轉錄試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自大連Takara公司；Transwell小室、基質膠購自美國Coming公司；放射免疫沉淀蛋白裂解液(RIPA)、電化學發光(ECL)發光液均購自碧云天生物技術公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2細胞培養 A549細胞接種到含10%胎牛血清+90%DMEM培養皿置于37℃、CO2體積分數5%的培養箱中培養。

1.3免疫組織化學實驗 將肺癌組織、癌旁組織置于4%甲醛磷酸鹽緩沖鹽水中固定，然后脫水，石蠟包埋，連續切片(4 μm厚)。用兔單克隆一抗和酶標抗兔二抗孵育后檢測TNF-α蛋白。DAB顯色5 min，在顯微鏡下掌握染色程度。然后用蘇木精復染2 min，脫水并封片。切片用光學顯微鏡(400×)進行評估。陽性細胞率=(陽性細胞數/癌細胞總數)×100%。陽性細胞率≥ 50%判定為陽性。

1.4細胞轉染和分組 分別用含0、10 nmol/L的TNF-α處理A549細胞，分別為對照組、TNF-α組。參照LipofectamineTM2000說明書分別轉染miR-363-3p mimics、miR-NC、anti-miR-NC、anti-miR-363-3p至A549細胞，標記為miR-363-3p組、miR-NC組、anti-miR-NC組、anti-miR-363-3p組。轉染48 h后進行qRT-PCR檢測miR-363-3p表達以檢測轉染效果。用10 nmol/L的TNF-α處理轉染miR-363-3p mimics、轉染miR-NC的A549細胞，標記為TNF-α+miR-NC組、TNF-α+miR-363-3p組。

1.5qRT-PCR實驗 Trizol法提取組織樣本、對照組、TNF-α組、miR-363-3p組、miR-NC組、anti-miR-NC組、anti-miR-363-3p組、TNF-α+miR-NC組、TNF-α+miR-363-3p組A549細胞總RNA。檢測RNA濃度和純度合格后，用逆轉錄試劑盒合成cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書操作，獲得Ct值，以2-△△Ct法計算miR-363-3p相對表達水平。每個樣品重復3次，取平均值。

1.6Western印跡實驗 向研磨組織、對照組、TNF-α組、miR-363-3p組、miR-NC組、anti-miR-NC組、anti-miR-363-3p組、TNF-α+miR-NC組、TNF-α+miR-363-3p組A549細胞中加入RIPA緩沖液，冰上裂解30 min，10 000 r/min離心10 min收集上清。將適量體積的5×上樣緩沖液與4倍體積的蛋白樣品混勻，煮沸10 min，然后進行電泳(電壓90 V，時間100 min)。用半干轉膜儀轉移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脫脂奶粉25 ℃封閉膜2 h；加入EZH2抗體4℃孵育過夜。次日，加入Ⅱ抗25℃孵育1 h。加入發光液，顯影，曝光。以EZH2與β-actin條帶灰度值的比值表示EZH2表達水平。

1.7四甲基偶氮唑藍(MTT)實驗 取適量1.2.2各組細胞，按20 μl/孔添加的MTT溶液(5 g/L)，培養3.5 h棄上清，按150 μl/孔添加二甲基亞砜(DMSO)，震蕩使甲瓚溶解。檢測490 nm吸光度(A)以表示細胞增殖能力。

1.8Transwell實驗 用無血清培養基將各組A549細胞調整密度至105個/ml，取100 μl加入Transwell裝置上室，取600 μl含血清培養基加入下室。培養箱孵育過夜后取出Transwell裝置，擦去上室內細胞，甲醇固定小室膜下表面遷移細胞30 min，甲醇固定后用結晶紫染色。顯微鏡下隨機選5個視野計數，取平均值表示細胞遷移能力。侵襲實驗采用包被基質膠的Transwell小室，其他步驟參考遷移實驗。

1.9雙熒光素酶報告基因檢測實驗 將含有miR-363-3p預測結合位點的EZH2野生序列及不含預測結合位點的EZH2突變序列分別克隆psiCHECK2載體，構建重組質粒WT-EZH2、MUT-EAH2。將WT-EZH2+miR-363-3p mimics、WT-EZH2+miR-NC、MUT-EAH2+miR-363-3p mimics、MUT-EAH2+miR-NC分別轉染A549細胞。轉染48 h。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分析轉染48 h相對熒光素酶活性。

1.10統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1肺癌組織中 TNF-α、miR-363-3p和EZH2的表達 與癌旁組織相比，肺癌組織中TNF-α、EZH2的相對值均顯著升高；qRT-PCR法檢測組織中miR-363-3p的表達，與癌旁組織相比，肺癌組織中miR-363-3p的表達顯著降低(均P<0.001)。見表1,圖1。

表1 miR-363-3p在肺癌組織和癌旁組織中的表達

圖1 TNF-α和EZH2在肺癌組織和癌旁組織中的表達

2.2TNF-α(10 nmol/L)對肺癌細胞增殖和遷移侵襲的影響 與Con組相比，TNF-α組細胞活性(48、72 h)、遷移細胞量和侵襲細胞量顯著升高(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 TNF-α對A549細胞增殖和凋亡的影響

2.3TNF-α對A549細胞中miR-363-3p和EZH2表達的影響 與Con組相比，TNF-α組細胞EZH2 mRNA和EZH2蛋白表達顯著升高，miR-363-3p表達顯著降低，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表3、圖2。

圖2 Western印跡檢測EZH2蛋白水平表達

表3 TNF-α對A549細胞中miR-363-3p和EZH2表達的影響

2.4miR-363-3p過表達對A549細胞增殖和遷移侵襲的影響 與miR-NC組相比，miR-363-3p組細胞活性(48、72 h)、遷移細胞量和侵襲細胞量顯著降低，miR-363-3p表達顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 過表達miR-363-3p對A549細胞增殖和凋亡的影響

2.5miR-363-3p靶向EZH2 Target scan預測到miR-195靶向SUZ12結合的可能性很高(圖3)。與WT-EZH2+miR-NC組相比，WT-EZH2+miR-363-3p組細胞相對熒光活性顯著降低(1.39±0.14、0.47±0.06，t=10.462,P=0.001)；與MUT-EAH2+miR-NC組(1.43±0.11)比較，MUT-EAH2+miR-363-3p組相對熒光活性不受影響(1.02±0.10，t=4.777,P=0.009)。miR-363-3p組細胞中EZH2蛋白表達(0.11±0.03)與miR-NC組(0.56±0.05)比較顯著降低(P<0.05)；anti-miR-363-3p組細胞中EZH2蛋白表達(0.87±0.08)與anti-miR-NC組比較顯著升高(0.51±0.05，P<0.05)。見圖4。

圖3 miR-363-3p與EZH2的靶向關系預測

1～4:miR-NC組,miR-363-3p組,anti-miR-NC組,anti-miR-363-3p組圖4 Western印跡檢測EZH2蛋白水平表達

2.6過表達miR-363-3p逆轉了TNF-α對A549細胞增殖、遷移侵襲的促進作用 與Con組相比，TNF-α組細胞中EZH2蛋白表達、細胞活性(48、72 h)、遷移細胞量和侵襲細胞量顯著升高；與TNF-α+miR-NC組相比，TNF-α+miR-363-3p組細胞中EZH2蛋白表達、細胞活性(24、48、72 h)、遷移細胞量和侵襲細胞量顯著降低(P<0.05)。見表5、圖5。

表5 過表達miR-363-3p逆轉了TNF-α對A549細胞增殖、遷移侵襲的促進作用

1～4:Con組,TNF-α組,TNF-α+miR-NC組,TNF-α+miR-363-3p組圖5 Western印跡檢測EZH2蛋白水平表達

3 討 論

表觀遺傳學是在不影響DNA序列的前提下，引起可遺傳的基因變化或細胞表性變化，包括組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化等〔8〕。EZH2可通過核小體組蛋白H3K27的甲基化，對染色質構型及基因組穩定性產生影響，以改變細胞的生物學行為〔9〕。Frankel等〔10〕在肺腺癌的研究中用EZH2抑制劑JQEZ5治療EZH2高表達的肺腺癌小鼠和人肺腺癌細胞發現，EZH2抑制劑在體內和體外均具有抗腫瘤作用。Liu等〔11〕研究發現，EZH2在結腸炎患者和結腸炎小鼠中均高表達，失活EZH2可增強小鼠對結腸炎的敏感性，而EZH2在腸上皮細胞中過度表達可增強小鼠對結腸炎的抵抗力，其機制為EZH2整合了TNFα/ NFκB信號傳導的多方面作用，促進結腸炎的炎癥反應。Zingg等〔12〕報道，在小鼠的抗-CTLA-4或IL-2免疫療法期間，腫瘤內TNF-α產生和T細胞積聚導致黑素瘤細胞中Ezh2表達增加，這反過來沉默了它們自身的免疫原性和抗原呈遞，Ezh2失活逆轉了這種抗性并與抗-CTLA-4和IL-2免疫療法協同作用以抑制黑素瘤生長。本研究運用免疫組織化學法檢測了肺癌組織及癌旁正常組織中TNF-α和EZH2的蛋白表達表達發現，TNF-α、EZH2在肺癌中均為高表達，且TNF-α可促進肺癌細胞中EZH2的表達，這與其他癌癥中TNF-α和EZH2的表達相呼應。

TNF包括TNF-α和TNF-β是最早發現細胞因子，其可引起腫瘤組織出血壞死。。TNF-α主要由活化的單核巨噬細胞產生，其在細胞增殖、分化及炎癥中均具有重要作用〔13〕。TNF-α即可通過增強機體免疫力，發揮抑制腫瘤作用，也可通過促進腫瘤細胞增殖改變腫瘤微環境發揮促腫瘤生長作用，其對腫瘤細胞具有雙向作用〔14,15〕。Rawnaq等〔16〕在胰腺導管腺癌(PDAC)的研究中發現，多功能生長/分化因子(MK)在PDAC中表達異常升高，且在胰腺癌的其他組織學亞型中存在差異表達，而正常胰腺細胞不表達，此外，敲減MK的體外研究揭示了其與增殖、遷移的關聯，經過分析上游信號通路發現，TNF-α是PDAC中MK表達的主要誘導物。本研究用TNF-α處理肺癌細胞A549并用MTT法、Transwell法檢測發現，TNF-α可促進肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA在腫瘤的發生發展中的調節作用已得到公認，其中miR-363-3p在多種癌癥中均出現表達異常〔17〕。Wang等〔18〕在肺腺癌和癌旁正常肺組織的miRNA表達譜分析中發現，miR-363在肺腺癌和癌旁正常肺組織的表差出現明顯差異，且其與淋巴結的轉移相關。胡情保等〔19〕在非小細胞肺癌的研究中闡明，miR-363-3p在肺癌組織中的表達明顯低于癌旁組織，而在癌旁組織中的表達高于正常組織，并且miR-363-3p的表達與淋巴結轉移呈正相關。Wang等〔20〕證實miR-363-3p可抑制肺癌A549和H441細胞增殖和集落形成，且在小鼠腫瘤異種移植模型中驗證了miR-363-3p的抗致癌功能，其機制與靶向PCNA有關。本研究發現miR-363-3p在肺癌組織低表達，這與Wang等〔20〕的研究結果相一致；功能分析顯示，過表達miR-363-3p對A549細胞的增殖、遷移和侵襲均有抑制作用；miR-363-3p靶向負性調控EZH2蛋白表達；且過表達miR-363-3p可逆轉TNF-α對A549生物學行為的影響。

綜上，TNF-α可能通過下調miR-363-3p/EZH2通路促進肺癌細胞惡性生物學行為，這將為肺癌的預防和治療提供依據。