柑橘素對癲癇大鼠海馬組織氧化應激因子及Caspase-9的作用

邵延萱 羅文哲 薛晴 李晶

(佳木斯大學 1 2018級臨床醫學5班，黑龍江 佳木斯 154007； 2基礎醫學院；3研究生院)

癲癇因為頭部神經細胞同步化的高度放電(及細胞生物電異常)造成的一種發作性腦病。曾有學者指出〔1〕，氧自由基可參與癲癇的發作，其影響大腦正常功能的途徑可能是通過改變線粒體代謝實現的。而可以最直接地反映體內氧化還原狀態，就是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，其濃度改變可直接反映機體的氧化還原狀態〔2〕。 半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-9在細胞凋亡與壞死中可通過介導及執行死亡指令來發揮作用，癲癇發作同時伴有腦細胞的凋亡。作為黃酮類植物化合物的柑橘素，已有學者研究其可通過對抗炎癥和自由基生成、增加雌激素和一氧化氮(NO)數目來增強心功能發揮心臟保護效果〔3〕，對糖尿病患者也有顯著治療效果。還可降低血糖、預防血栓、抑制消化性潰瘍、氧化應激、腫瘤、炎癥反應、出血等生物學效應〔4～10〕。本研究探討柑橘素對癲癇大鼠海馬組織氧化應激標志物 GSH-Px、SOD、MDA 濃度變化及Caspase-9的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性成年SD大鼠30只，體重180～220 g〔哈爾濱醫科大學附屬第二醫院實驗動物中心，合格證號SCXK(黑) 2015-001〕，依隨機數字法分成空白組、癲癇組、柑橘素組各10只。研究經佳木斯大學倫理委員會(JMSU-227)批準合格，經1 w的適應性喂養后開始實驗。

1.2藥物、主要試劑和儀器 Sigma 公司購買的柑橘素和戊四氮(PTZ)；南京建成生物工程研究所購買的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒、氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑；武漢博士德公司購買的兔抗 Caspase-9 多克隆抗體、鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)及枸櫞酸鈉緩沖液、多聚賴氨酸；成都泰盟科技有限公司的BI-2000醫學圖像分析系統；日本三洋電器有限公司的醫用超低溫冰箱；上海安亭科學儀器廠生產的TGL-168高速臺式離心機；寧波新芝科學儀器研究所的電動玻璃勻漿機。

1.3動物分組及制造模型 將適應性喂養后的大鼠隨機分為空白組(0.9%氯化鈉溶液灌胃+0.9%氯化鈉溶液腹腔注射)、癲癇組(0.9%氯化鈉溶液灌胃+PTZ腹腔注射)、柑橘素組(柑橘素溶液灌胃+PTZ腹腔注射)。給予劑量：50 mg/kg灌胃，35 mg/kg腹腔注射；連續28 d，每天固定時間段進行操作，觀察并記錄大鼠是否有癲癇發作及發作表現。灌胃前禁食以增加吸收效果。造模成功標準按大鼠行為學表現判定(Ⅱ級或Ⅱ級以上發作持續5次)。

1.4行為學改變 依據Racine 6級指標來判定：0級：無任何發作形式的表現；Ⅰ級：頭部抽動或點頭、咀嚼樣動作；Ⅱ級：有間斷性咀嚼動作，點頭現象也頻繁出現、有的上身會有像濕狗一樣的抖動；Ⅲ級：雙上肢或單側上肢有顫搐、陣攣；Ⅳ級：雙上肢抽搐并伴有直立動作；Ⅴ級：強直性陣攣與抽搐現象逐漸蔓延擴展到全身，嚴重時大鼠不能正常站立，甚至直接跌倒在地。

1.5海馬組織中SOD、GSH-Px、MDA濃度 完成行為學監測后進行取材操作。按體重進行麻醉操作(麻醉藥用戊巴比妥鈉)，待麻醉穩定時斷頭處死，剪下鼠頭，在預先凍好的冰塊上迅速分離出大腦組織，并且嚴格按照大鼠大腦圖譜結構中準確定位仔細分離好所需的海馬組織，小心操作備用。漂洗血液用冰生理鹽水進行，拿濾紙片把多余的鹽水吸干凈，配成 10%的海馬組織勻漿液(海馬與鹽水比例為1∶9)，經離心后(10 min，3 000 r/min)取上清液備有。檢測海馬組織中3種因子的濃度嚴格按試劑盒說明書操作所有步驟。

1.6海馬組織中Caspase-9陽性細胞數 海馬組織免疫組化染色觀察并計算陽性細胞數。分離出的海馬用甲醛固定后石蠟包埋，加入Caspase-9一抗，待4℃過夜后加二抗、辣根過氧化物酶標記的工作液，經二氨基聯苯胺(DAB)顯色后復染(蘇木素)，檢測海馬中的陽性細胞。光鏡下看到胞核棕黃色即陽性細胞。視野下選擇不重復的視覺區域范圍，計算符合條件的胞核或胞質呈黃染的陽性細胞數目總數，取平均值。

1.7統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.13組行為學改變 癲癇組一般會出現肌陣攣及縮頭動作；而有的大鼠也有其他一系列全身或局部的狀態表現：如口唇發紺、呼吸受抑、眼球充血、前后肢痙攣抽搐或全身強直陣攣發作。這些發作表現通常會發生在給予PTZ腹腔注射的3 min以后，大多數大鼠一般在給藥后的7 min內基本可以表現出典型的行為學改變，即達到發作高潮階段；多數大鼠癥狀會在20 min之內逐漸減輕至最終恢復安靜狀態。空白組沒有行為改變。相對癲癇組，柑橘素組躁動或抽搐的程度明顯緩解或減輕，發作的潛伏期也延長了。

2.23組海馬組織中SOD、GSH-Px、MDA濃度變化 癲癇組海馬組織中SOD、GSH-Px濃度較空白組顯著降低，而MDA濃度顯著增加(均P<0.05)；柑橘素組海馬組織中SOD、GSH-Px含量較癲癇組顯著升高，而MDA濃度顯著下降(P<0.05)，見表1。

表1 3組海馬組織中SOD、GSH-Px、MDA濃度的變化

2.33組海馬組織中Caspase-9陽性細胞數變化 癲癇組Caspase-9陽性細胞數〔(31.98±2.47)個/視野〕顯著多于對照組〔(15.37±0.45)個/視野〕；而柑橘素組Caspase-9陽性細胞數〔(19.86±0.54)個/視野〕顯著低于癲癇組(P<0.05)。

2.4海馬組織Caspase-9免疫組化染色結果 鏡下可見空白組細胞整齊排列、呈正常形態、胞核染色也很淺，有較大的胞體；癲癇組陽性細胞數大幅增加，胞核染色深且不規則、有時會有胞核碎裂和聚集；柑橘素組較癲癇組陽性細胞數降低尤為明顯。見圖1。

空白組

3 討 論

氧化應激是參與癲癇發病造成腦損傷的重要內在機制〔11,12〕，而細胞凋亡又是影響疾病進程的主要途徑。癲癇時抗氧化系統和增多的氧自由基之間平衡失調，加快細胞凋亡進程。所以說腦神經細胞的有效保護方式可從對抗氧化應激入手。其中，抗氧化劑SOD可最直接反映機體抗氧化水平，它對細胞產生保護作用可因降低過氧化脂質產生，除掉一些超氧陰離子發揮作用。脂質自由基降解后的產物是具有毒性的MDA〔13〕，機體細胞損傷的嚴重程度可靠其濃度變化間接反映出來〔14〕。GSH-Px〔15〕能降低脂質過氧化作用對機體的損傷，還具備降解膽固醇過氧化物等生物學作用〔16〕。本研究說明柑橘素可抵抗脂質過氧化作用，雙向調節抗氧化酶活性(上調SOD、GSH-Px；下調MDA)而起到腦細胞保護效果。其可能是由于SOD可把體內超氧陰離子除掉后使過氧化脂質減少生成，進而發揮了細胞膜的保護，減弱了這些自由基對大腦的損害〔17〕。

細胞凋亡通路的重要啟動因子為Caspase-9，這其中又包含3個相互聯系的通路：死亡受體(以Caspase-8啟動)〔18〕、線粒體(以Caspase-9啟動)〔19〕、內質網(以Caspase-12啟動)〔20〕。本研究提示PTZ建立的癲癇模型誘發了Caspase-9被激活，而Caspase-9又和癲癇造成的凋亡現象有關。而柑橘素可通過介導細胞凋亡途徑來達到保護神經細胞的效果。作為黃酮類植物化合物的柑橘素，有很大潛力和生物學作用，可改善心受損肌和動脈硬化、降低癌癥細胞增殖與炎性因子濃度、消除自由基等。綜上，柑橘素可能通過消除自由基生成、強化抗氧化酶活性、削弱細胞凋亡等方式對癲癇大鼠神經細胞發揮保護效果。