miR-183靶向Orai1基因影響高糖誘導的足細胞增殖和凋亡

李媛 孫愛東 許聿新 韓森吉

(淄博市第一醫(yī)院 1內分泌科，山東 淄博 255200；2產(chǎn)科)

糖尿病腎病是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，其發(fā)生機制尚未明確。研究顯示足細胞在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用〔1〕。高糖(HG)是影響足細胞增殖和凋亡的重要因素，即可直接損傷足細胞，誘導細胞凋亡，又可引起足細胞裂隙膜分子的完整性受損，發(fā)生蛋白尿〔2，3〕。從分子水平探討影響HG誘導的足細胞增殖和凋亡的機制，對于糖尿病腎病治療靶點的尋找有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，長度為18～25個核苷酸，參與調控細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為，與糖尿病、心血管疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關〔4～6〕。底建敏等〔7〕研究顯示，miR-183可通過抑制子宮內膜癌細胞的增殖，并促進細胞凋亡，影響子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展和預后。王曉晶〔8〕研究顯示，miR-183在2型糖尿病中差異性表達，提示miR-183可能與糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關。目前，還未有miR-183影響足細胞增殖和凋亡的相關報道。本研究通過HG誘導足細胞，探討miR-183對HG誘導的足細胞增殖和凋亡的影響及可能的作用機制，以期為糖尿病腎病的治療尋找新靶點。

1 資料與方法

1.1細胞和實驗試劑 小鼠足細胞(國家細胞庫基礎醫(yī)學細胞中心-協(xié)和細胞庫)；胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)和胰蛋白酶(美國Sigma公司)；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；鈣通道調節(jié)分子(Orai)1單克隆抗體(艾美捷科技有限公司)，酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3多克隆抗體(美國Abnova公司)；磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)及磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)單克隆抗體(北京中杉金橋公司)；miR-183模擬物(mimics)及模擬陰性對照物、miR-183抑制劑及陰性對照和Orai1過表達載體(上海英駿生物技術有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(上海碧云天公司)；雙熒光素酶活性檢測試劑盒(美國Promega公司)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 各細胞均用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基。當細胞融合度達到80%左右時，吸棄培養(yǎng)基，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞，然后加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2細胞轉染和分組 對數(shù)生長期的足細胞接種于6孔板中，每孔1×105個細胞。細胞融合度達到60%時，更換無FBS的培養(yǎng)基。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別轉染miR-183 mimics(miR-183組)及模擬陰性對照物(miR-NC組)、miR-183抑制劑(anti-miR-183組)及抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC組)、Orai1的過表達載體(pcDNA-Orai1組)及空載體(pcDNA組)、Orai1的小干擾RNA(si-Orai1組)及亂序無意義陰性序列(si-con組)、共轉染miR-183 mimics和Orai1過表達載體(miR-183+pcDNA-Orai1組)、miR-183 mimics和空載體(miR-183+si-con組)至足細胞。足細胞分為對照組(NG組)：常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)；HG6 h、HG12 h、HG24 h組：30 mmol/L的D-葡萄糖分別作用足細胞6 h、12 h、24 h。miR-183組、miR-con組、si-Orai1組、si-con組、miR-183+pcDNA-Orai1組和miR-183+si-con組細胞均使用30 mmol/L的D-葡萄糖作用24 h，并依次記為HG+miR-183組、HG+miR-con組、HG+si-Orai1組、HG+si-con組、HG+miR-183+pcDNA-Orai1組和HG+miR-183+si-con組。

1.2.3MTT檢測足細胞增殖 將足細胞或轉染后的各組足細胞接種于96孔板中，每孔1×103個細胞。按照上述分組處理后，每孔加入20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜，輕輕振蕩混合均勻，于酶標儀490 nm處測定吸光度值(A)，并計算細胞存活率。細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞分組和處理同1.2.3，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化并收集細胞。取1.0×106個細胞，適量PBS清洗2次。吸棄PBS，加入400 μl結合緩沖液，輕輕吹打使細胞混懸。加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min。再加入5 μl碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育5 min。最后再加入100 μl結合緩沖液，混勻后上流式細胞儀檢測。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測miR-183和Orai1 mRNA表達水平 Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，微量核酸儀測量RNA的濃度和純度，A260 nm/A280 nm比值處于1.8～2.0范圍內的RNA純度較高。使用逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄為cDNA。再以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR總反應體系為20 μl，擴增條件為95℃20 s，95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共進行35個循環(huán)。miR-183上游5′-CGTAGGGCCACTGGACGA-3′，下游5′-TTGTCCCCATTCCAGCCCTG-3′；Orai1上游5′-CTGCTGGGTCAAGTTCTTA-3′，下游5′-AGTGAACAGCAAAGACGATA-3′；U6上游5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3′；GAPDH上游5′-CATCACCATCTTCCAGGAGCG-3′，下游5′-GAGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。miR-183以U6為內參，Orai1以GAPDH為內參，2-△△Ct法計算miR-183和Orai1 mRNA的相對表達水平。

1.2.6Western印跡檢測蛋白表達 加入含蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，提取細胞中總蛋白。BCA蛋白試劑盒定量后，取適量蛋白，100℃煮沸5 min。蛋白變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每泳道30 μg蛋白。電泳結束后，濕轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶中封閉，時間為2 h。分別加入一抗，4℃孵育過夜。再加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗IgG，室溫孵育1 h。最后加入化學發(fā)光試劑ELC，避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.7雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-183與Orai1靶向關系 生物信息學軟件預測顯示：Orai1的3′UTR中含有與miR-183互補的核苷酸序列。PCR擴增含有與miR-183互補的Orai1的3′UTR序列，構建Orai1野生型質粒(WT-Orai1)和突變型質粒(MUT-Orai1)。分別共轉染Orai1-WT、Orai1-MUT與miR-183mimic、模擬陰性對照物至足細胞。轉染48 h后，收集細胞。使用細胞裂解液裂解細胞，取上清液，檢測各組的熒光素酶活性。具體操作過程參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1HG刺激對足細胞增殖、凋亡及miR-183和Orai1表達影響 與NG組比較，HG6 h、HG12 h、HG24 h組細胞存活率和miR-183水平顯著降低，而細胞凋亡率、酶切Caspase-3蛋白、Orai1 mRNA和蛋白水平顯著升高(均P<0.05)。由于HG24 h組細胞存活率接近50%，所以選擇HG作用時間為24 h作為后續(xù)實驗條件。見表1，圖1，圖2。

表1 HG處理足細胞miR-183和Orai1的表達

圖1 流式細胞術檢測足細胞中Orai1蛋白表達

圖2 Western印跡檢測Orail、酶切Caspase-3蛋白表達

2.2上調miR-183表達對HG誘導的足細胞增殖和凋亡的影響 與HG+miR-con組比較，HG+miR-183組miR-183水平顯著升高(P<0.001)，表明miR-183 mimics轉染成功，足細胞中miR-183表達上調。與HG+miR-con組比較，HG+miR-183組細胞存活率顯著升高(P<0.001)，細胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平顯著降低(均P<0.001)。見圖3，表2。

圖3 足細胞凋亡相關蛋白酶切Caspase-3表達

表2 上調miR-183表達對高糖誘導的足細胞增殖、凋亡的影響

2.3miR-183靶向調控Orai1表達 生物信息學軟件預測顯示，Orai1的3′UTR的存在與miR-183互補的核苷酸序列。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與miR-con組比較，miR-183組轉染W(wǎng)T-Orai1的熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)，說明miR-183可與Orai1的3′UTR靶向結合。見表3。Western印跡檢測顯示，miR-183組Orai1蛋白水平(0.23±0.04)顯著低于miR-con組(0.57±0.06，P<0.05)，anti-miR-183組Orai1蛋白水平(0.833±0.08)顯著高于anti-miR-con組(P<0.05)，說明miR-183靶向負調控Orai1表達。見圖4，圖5。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖4 miR-183與Orai1互補的核苷酸序列

圖5 Western印跡檢測Orai1蛋白表達

2.4沉默Orai1對HG誘導的足細胞增殖和凋亡的影響 與HG+si-con組比較，HG+si-Orai1組Orai1蛋白水平顯著降低(P<0.001)，與HG+si-con組比較，HG+si-Orai1組細胞存活率顯著升高(P<0.001)，細胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.001)。見表4，圖6。

表4 沉默Orai1表達對HG誘導的足細胞增殖、凋亡的影響

圖6 足細胞中Orai1和酶切Caspase-3蛋白表達

2.5過表達Orai1部分逆轉上調miR-183表達對HG誘導的足細胞的增殖和凋亡的影響 與HG+miR-183+pcDNA組比較，HG+miR-183+pcDNA-Orai1組細胞存活率顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平顯著升高(均P<0.001)。見圖7、表5。

1，2:HG+miR-183+pcDNA組、HG+miR-183+pcDNA-Orai1組圖7 足細胞中Orai1和酶切Caspase-3蛋白表達

表5 過表達Orai1逆轉上調miR-183表達對足細胞增殖和凋亡的抑制作用

2.6過表達Orai1部分逆轉上調miR-183表達對HG誘導的足細胞Akt信號通路的影響 與NG組比較，HG組p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與HG+miR-con組比較，HG+miR-183組p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。與HG+miR-183+pcDNA組比較，HG+miR-183+pcDNA-Orai1組p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖8，表6。

1～6:NC組、HG組、HG+miR-con組、HG+miR-183組、HG+miR-183+pcDNA組、HG+miR-183+pcNDA-Orai1組圖8 足細胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表達

表6 過表達Orai1逆轉上調miR-183表達對HG誘導的足細胞p-AKT和p-mTOR蛋白表達的影響

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病患者死亡的主要原因之一。足細胞是維持腎小球濾過膜正常通透性的主要成分，其功能受損可引起腎功能損傷，是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展的關鍵〔9〕。HG環(huán)境可導致足細胞數(shù)量減少，足細胞從基底膜脫落等，最終導致腎小球濾過屏障通透性增加，發(fā)生蛋白尿、腎小球硬化、腎功能喪失〔10〕。本研究結果顯示HG作用足細胞后，細胞增殖受到抑制，凋亡加劇，酶切Caspase-3蛋白表達水平升高，與相關研究報道結果一致〔11〕。阻止足細胞脫落、凋亡，維持其正常功能是防治及延緩糖尿病腎病發(fā)展進程的關鍵因素之一。

miRNA參與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展〔12〕。miR-183是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，參與調控細胞的增殖和凋亡。于健等〔13〕研究顯示，子宮內膜癌組織中miR-183呈低表達，上調miR-183表達可能通過抑制Akt1的表達抑制子宮內膜癌細胞的增殖。Wang等〔14〕研究顯示，miR-183在鼻咽癌組織和細胞中表達降低，上調miR-183表達明顯抑制鼻咽癌細胞的增殖和侵襲，并促進順鉑誘導的鼻咽癌細胞凋亡。目前miR-183對足細胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究結果提示miR-183可能參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展；miR-183是糖尿病腎病治療的潛在靶點。

Orai1是定位于質膜上的四次跨膜蛋白，也是鈣釋放激活鈣通道的主要成分。鈣釋放激活鈣通道與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關〔15〕。Zbidi等〔16〕研究顯示，Orai1在2型糖尿病患者血小板中表達升高，與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展相關。陳夢楠等〔17〕研究顯示，HG在一定程度上抑制心肌細胞增殖，與HG誘導后心肌細胞中Orai1表達升高有關。目前，Orai1對HG誘導的足細胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究結果提示Orai1可促進糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展。提示上調miR-183表達通過下調Orai1表達影響HG誘導的足細胞增殖和凋亡。

mTOR是雷帕霉素在哺乳動物的靶分子，參與哺乳動物細胞感受營養(yǎng)信號、細胞增殖和生長信號的調控。Akt/mTOR信號通路參與糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。HG環(huán)境下，Akt/mTOR信號通路處于激活狀態(tài)〔18〕。腎小球足細胞mTOR活性的異常升高是糖尿病腎病發(fā)生蛋白尿的關鍵機制之一。本研究結果顯示，HG誘導后，足細胞中p-AKT和p-mTOR蛋白表達升高，與相關研究報道結果一致〔19〕，HG誘導激活了足細胞中Akt/mTOR信號通路。上調miR-183表達后，HG誘導的足細胞p-AKT和p-mTOR蛋白表達受到抑制，而過表達Orai1逆轉了上調miR-183表達對HG誘導的足細胞p-AKT和p-mTOR蛋白表達的抑制作用，提示上調miR-183表達可能通過下調Orai1表達，進而抑制HG誘導的Akt/mTOR信號通路激活，保護足細胞免受損傷。

綜上，miR-183在HG誘導的足細胞中表達降低，上調miR-183表達可促進HG誘導的足細胞增殖，抑制凋亡，這可能與miR-183靶向負調控Orai1表達及抑制Akt/mTOR信號通路的激活相關。