平肝補腎方對圍絕經(jīng)期綜合征細胞模型ERK信號通路蛋白的調(diào)控

權興苗 宋春俠 范麗潔 徐立偉 劉玉蘭 王月

(1承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院中醫(yī)科，河北 承德 067000；2河北中醫(yī)學院)

圍絕經(jīng)期綜合征(PMS)主要發(fā)生于絕經(jīng)期女性患者，就診主訴多為五心煩熱，心悸失眠，煩躁易怒和心緒不寧，病情嚴重者可影響正常的生活和工作〔1,2〕。既往研究表明，祖國醫(yī)學對于PMS有一定的療效，二仙湯〔3〕和六味地黃丸〔4〕均可在一定程度上緩解PMS的臨床癥狀，但效果有限。平肝補腎方是最新興起的一種中醫(yī)藥治療方案。主要針對腎虛的主要癥狀，其以溫腎陽，滋腎陰，瀉腎火為主，以適應陰陽俱虛于下的癥狀〔5,6〕。本研究以平肝補腎方為治療方案，構建PMS細胞模型，觀察其對PMS治療效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物與材料 胎牛血清(FBS，BI公司，以色列)；DMEM培養(yǎng)液、AV-PI凋亡試劑盒及2.5 g/L胰酶Trypsin(Invitrogen公司，美國)；Trizol及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司,日本)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR)儀(Bio-Rad公司，美國)；Transwell試劑盒及CCK-8試劑盒(北京碧云天公司，中國)，以SPF級雌性離乳大小鼠30只為研究對象，體重(91.3±3.6)g，購自山東省濟南市實驗動物中心許可證書編號：〔SCXK(魯)2016-0893〕。

1.2方法

1.2.1PMS細胞模型的構建〔7〕待雌性SD大鼠性成熟后，脫頸椎處死，放入盛有75%酒精的玻璃缸內(nèi)，浸泡2 min以消毒。取至無菌潔凈臺，解剖刀處理SD大鼠，在無菌的條件下，把卵巢及周圍附著的脂肪組織一并取出，迅速放入滅菌的25 cm2培養(yǎng)皿內(nèi)，然后在超凈臺內(nèi)用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗卵巢3次。解剖刀去除多余的脂肪、結締組織和輸卵管等附件，再次用含5%FBS的培養(yǎng)基沖洗1次，放入盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下用注射針頭刺破卵泡，輕輕擠壓，鋼篩過濾，1 500 r/min離心，細胞計數(shù)儀計數(shù)；用0.4%的臺盼藍染色計數(shù)，細胞活率為(91.98±7.99)%。同時利用Transwell試劑盒的上室和下室，以105個/cm2細胞數(shù)接種于Transwell試劑盒下室，進而構建PMS細胞模型。

1.2.2平肝補腎藥方配伍 方藥組成：柴胡15 g，玄參15 g，生地10 g，熟地10 g，郁金10 g，白芍15 g，知母10 g，梔子15 g，地骨皮15 g，青蒿20 g，丹皮12 g，五味子15 g，夜交藤30 g，浮小麥30 g，甘草10 g。所有藥物均經(jīng)水煎。取汁待用。

1.2.3細胞分組 根據(jù)實驗目的，將構建好的PMS細胞模型分成3組，即中藥組，細胞給予上述平肝補腎藥方處理，1 ml/孔，處理12 h；抑制劑組，即細胞在平肝補腎藥方處理的基礎上，增加細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)5的抑制劑BIX02188處理，12 μl/ml，處理12 h；空白對照組，細胞加入等量PBS。

1.3細胞功能學分析 3組細胞經(jīng)上述方法處理12 h后，利用胰蛋白酶進行消化和收集，接種于96孔板中。按照CCK-8試劑盒說明書要求，加入各試劑，孵育30 min后，450 nm波長酶標儀測定吸光度值，之后每30 min檢測1次吸光度，直到4 h為止。按照AV-PI的試劑盒的說明書加入各試劑，流式細胞儀分析各組樣本，計算各組凋亡率。

1.4細胞靶分子的定量分析

1.4.1qPCR試劑盒檢測ERK5和凋亡因子表達 3組細胞經(jīng)上述方法處理12 h后，利用胰蛋白酶進行消化和收集，加入1 ml Trizol 試劑，充分混合后，提取細胞總RNA，室溫條件下根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，配制20 μl的逆轉(zhuǎn)錄體系，加入總RNA，37℃水浴箱孵育30 min，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃低溫冰箱保存。然后根據(jù)qPCR試劑盒說明書，配制50 μl的qPCR體系，加入cDNA和ERK5，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-6和Caspase-3的引物模板，ERK5：正義鏈5'-CAUAAUAGACGGGACUAGAATA-3'，反義鏈5'-CCTGGCUGACUUGAAUAUGTT-3'；Caspase-3：正義鏈5'-TTGCTAGGTCCTGTCTTCAGATGA-3'，反義鏈5'-CCGATAAGCTCCGTTTCCTGGTTC-3'；Caspase-6：正義鏈5'-GTCGTATGCAGGTTTCGGTTGCTG-3'，反義鏈5'-TGTAAGCCGTGGCTCAATCCTCTC-3'；GAPDH：正義鏈5'-GCCTCTCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反義鏈5'-AAGCTGCTGGTGAAGAGCCAGTGGA-3'。置于Applied Biosystems PCR儀進行反應，設置條件按照說明書。統(tǒng)計并記錄個樣本CT值，利用2-△△CT的方法計算目的基因的相對表達量。

1.4.2Western印跡檢測ERK5和凋亡因子表達 3組細胞經(jīng)上述方法處理12 h后，PBS清洗后，加入2 ml RIPA細胞裂解液，冰上裂解和收集細胞碎片，加入PE管中，預冷高速離心機，4℃，12 000 r/min，收集總蛋白，加入10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)，99℃煮沸，BAD試劑盒測定蛋白的分子量。按照說明書，配制10%分離膠和4%濃縮膠，加入50 ng蛋白量，1×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液浸沒膠板，40 V電泳2 h后轉(zhuǎn)染到硝酸纖維素膜，TBST洗膜后，過夜孵育ERK5，Caspase-3和Caspase-6的蛋白一抗，TBST液洗膜，常溫孵育鼠抗山羊辣根過氧化物酶(HRP)二抗30 min，DAB顯影，Image J 軟件分析蛋白條帶。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.13組細胞增殖能力比較 自第12小時起，中藥組細胞增殖率均明顯高于空白對照組，抑制劑組細胞增殖率均明顯低于空白對照組和中藥組(均P<0.05)，見表1。

表1 3組細胞的增殖率比較

2.23組細胞凋亡水平比較 中藥組凋亡率〔(1.13±0.35)%〕明顯低于空白對照組〔(5.13±0.91)%〕和抑制劑組〔(47.97±3.36)%，P<0.05〕；且抑制劑組凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.05)。

2.33組ERK5和凋亡因子Caspase-6和Caspase-3 mRNA表達水平比較 3組ERK5 mRNA水平比較：中藥組>空白對照組>抑制劑組(均P<0.05)，3組Caspase-6和Caspase-3 mRNA水平比較：抑制劑組>空白對照組>中藥組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組ERK5、Caspase-6、Caspase-3 mRNA相對表達量

2.43組細胞ERK5和凋亡因子Caspase-6和Caspase-3蛋白表達水平比較 3組ERK5蛋白水平比較：中藥組>空白對照組>抑制劑組(均P<0.05)；3組Caspase-6、Caspase-3蛋白水平比較：抑制劑組>空白對照組>中藥組(均P<0.05)，見表3，圖1。

表3 3組ERK5、Caspase-6、Caspase-3蛋白相對表達量比較

1～3：中藥組,空白對照組，抑制劑組圖1 Western 印跡檢測Caspase-3、Caspase-6及ERK5蛋白表達

3 討 論

PMS往往與機體內(nèi)的激素水平改變相關。其主要癥狀為煩躁易怒，頭暈目眩等〔8,9〕。流行病學統(tǒng)計結果表明，19%～30%的PMS患者可影響正常的工作和生活，治療愿望迫切〔10〕。PMS主要與機體的激素水平相關，在絕經(jīng)期，機體的雌激素急劇下降，造成了卵巢在短時間內(nèi)急劇收縮，卵巢細胞大量凋亡，此為PMS發(fā)生的基礎。本研究在此基礎上探究平肝補腎藥方對PMS細胞模型凋亡和增殖水平的影響，結果證明平肝補腎藥方對PMS細胞模型的增殖和凋亡有調(diào)節(jié)作用。

ERK5是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)系統(tǒng)中的關鍵分子蛋白，其激活參與細胞的增殖與凋亡〔11,12〕。既往研究表明，ERK5參與機械牽張應力作用下軟骨細胞的凋亡〔13〕，參與大鼠海馬組織在缺氧無糖環(huán)境刺激下的過度凋亡〔14〕。可見，任何細胞外的化學信號，生物力學信號及缺氧信號等均可通過激活ERK5信號通路參與細胞凋亡和增殖。本研究說明平肝補腎藥方通過激活ERK5的表達，促進細胞的增殖，抑制細胞的凋亡。

Caspase家族參與細胞的凋亡，其中Caspase-3的激活往往啟動細胞的凋亡，進一步導致細胞的死亡，因此，Caspase-3也被稱作“死亡蛋白”〔15，16〕。而Caspase-6蛋白作為Caspase-3的啟動因子也多見報道〔17〕。本研究說明平肝補腎藥方通過抑制Caspase-3和Caspase-6蛋白的表達，抑制細胞的凋亡。

綜上，平肝補腎方通過激活ERK5信號通路，抑制Caspase-3和Caspase-6蛋白的表達，進而促進細胞增殖，抑制細胞凋亡。