肝細胞癌抗原587基因甲基化調節HCA587-TAF9互作介導肝細胞癌的侵襲和遷移*

冷 雪 劉 萍 陳 楨 周 亮

（1 遂寧市中醫院病理科，遂寧 629000；2 瀘州市人民醫院病理科，瀘州 646000；3 遂寧市中醫院檢驗科，遂寧 629000；4 四川大學華西基礎醫學與法醫學院，成都 610065）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是中國第三大與癌癥相關的死亡原因[1]。病因包括乙型/丙型肝炎病毒（hepatitis B virus/hepatitis C virus，HBV/HCV）感染、慢性酒精中毒、黃曲霉毒素、吸煙、肥胖和糖尿病等[2]。術后肝內或肝外轉移的高發生率仍然是肝細胞癌難以治愈的關鍵原因之一[3]。已發現多個基因靶點或啟動子區甲基化狀態與肝細胞癌的預后密切相關[4]。Wang等[5]通過對肝細胞癌重組cDNA表達文庫的血清學分析，鑒定了肝細胞癌相關抗原587（hepatocellular carcinoma-associated antigen 587，HCA587）基因，其序列與黑素瘤相關抗原C2（melanoma-associated antigen C2，MAGEC2）的序列相同。最新的研究證據顯示，HCA587能夠通過TATA盒結合蛋白相關因子9（TATA-box binding protein associated factor 9，TAF9）相互結合，并發揮致癌功能[6]。HCA587與癌癥轉移相關[7-8]。王萬祥等[9]認為，HCA587 mRNA作為腫瘤標志物來檢測循環肝癌細胞，可用于肝細胞癌的輔助診斷和作為監測復發、轉移和預后的指標。然而，到目前為止，幾乎沒有關于HCA587的上調與其啟動子區甲基化的相關報道。本研究假設HCA587啟動子區甲基化狀態失調與HCA587的上調相關，并因此而促進肝細胞癌細胞的轉移。本實驗通過臨床肝細胞癌組織檢測HCA587的表達和啟動子區甲基化變化，體外檢測HCA587對肝細胞癌細胞的遷移和侵襲的影響。

1 材料和方法

1.1 患者和組織樣本

從2016年12月至2019年12月，于遂寧市中醫院病理科收集114例接受手術治療肝癌病例的肝細胞癌組織和癌旁非癌組織。納入標準如下：診斷為肝細胞癌的患者；術前無放療或化學療法。排除標準如下：手術前接受過放療或化療的患者；另外，本研究從114例中隨機選擇3例接受手術治療，收集這3例肝細胞癌新鮮組織以及石蠟包埋組織和各自匹配的非癌組織，用于免疫組織化學和免疫印跡檢測。本研究記錄每位患者年齡、性別、腫瘤大小、分化程度、原發腫瘤局部淋巴結遠處轉移（tumor node metastasis，TNM）分期等信息。

1.2 試劑與耗材

人肝細胞癌細胞BEL-7404購于武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI-1640培養基購自美國Hyclone公司；TRIzol 試劑購自美國Invitrogen公司；反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司；HCA587一抗購于美國Abcam公司；甲基化抑制劑5-Azacytidine購于上海浩然生物技術有限公司；HCA587的重組高表達質粒（pcDNA3.1-HCA587）和其空載體（empty vector，EV）購于上海吉瑪公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen（ThermoFisher Scientific）公司；實時定量PCR（real time-qPCR）引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；EasyBlot購于美國GeneTex公 司；BeaverBeads? GSH-GST蛋 白純化磁珠購于蘇州海貍公司；Transwell 小室購自Corning公司（美國）；Matrigel 基底膜基質購自美國BD公司。

1.3 RT-PCR檢測肝細胞癌組織中HCA587的表達

使用TRIzol一步法提取細胞總RNA，逆轉錄后得到cDNA，以GAPDH為內參基因，進行熒光定量PCR檢測。HCA587基因的熒光定量PCR引物見表1。PCR反應條件為95℃預變性6 min；97℃變性10 s，55℃退火20 s，70℃延伸35 s，共38個循環。每個樣本重復檢測2次。mRNA相對表達量以2-△△Ct表示。

表1 HCA587基因引物序列

1.4 HCA587基因啟動子區甲基化檢測

提取肝細胞癌組和癌旁組中的DNA，每組DNA樣品均進行甲基化敏感酶HhaⅠ酶切、甲基化依賴酶McrBC酶切處理，并以非酶切樣本作為對照。甲基化敏感酶HhaⅠ特異性識別，并切開非甲基化的CGCG位點，甲基化依賴酶McrBC特異性識別，并酶切PumCG（N40-3000）位點。酶切體系為：限制酶4 μL，NEB buffer 5 μL，1 mmol/L GTP，BSA 100 μg/mL，DNA 4 μg，用去離子H2O補至總體積50 μL。37℃ 酶切16 h，65℃ 20 min滅活酶活性。

在HCA587基因CpG島區域設計引物，擴增區域同時含有甲基化敏感酶和甲基化依賴酶的酶切位點。熒光定量PCR反應總體系為15 μL：酶切產物2 μL，HCA587-MF和HCA587-MR引物各1 μL，2×PCR master mix 3.0 μL，dNTP 1 μL，去離子H2O 8 μL。結果判斷：若DNA樣本HhaⅠ酶切后熒光定量PCR檢測到特異片段的擴增，而McrBC酶切后無擴增，則判斷此樣品存在甲基化；若HhaⅠ酶切后無擴增，而McrBC酶切后擴增陽性，則判斷為無甲基化。Ct值≥35個循環認為無擴增。

1.5 免疫印跡檢測

取1～3號患者肝細胞癌標本，冷藏研磨，用磷酸鹽緩沖液清洗后加入裂解液，置于EP管中，后離心（4 ℃，13 000 r/min，20 min）。取上清液，用牛血清白蛋白法測定蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用電轉（恒電流200 mA，120 min，冰水?。?，脫脂奶粉封閉2 h，加入HCA587一抗（1∶500）后在4 ℃下孵育過夜。次日 Tris-HCl 緩沖液漂洗3次后，加入二抗孵育 1 h，再用Tris-HCl 緩沖液漂洗3次，用化學發光顯色、拍照，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）為內參。

1.6 細胞培養和轉染

BEL-7404培養采用10%胎牛血清配制的RPMI-1640培養基，并置于37℃、5% CO2的培養箱中。轉染前1 d將BEL-7404細胞接種于24孔板中。嚴格根據合成商提供的說明，使用5-Azacytidine、pcDNA3.1-HCA587及EV對BEL-7404進行分別處理，處理時間為24 h。

1.7 免疫沉淀

根據制造商的說明，采用純蛋白組蛋白磁珠系統進行免疫沉淀實驗。采用HCA587和rIgG制備抗體磁珠。隨后按照免疫印跡方法進行結果分析。使用EasyBlot作為二抗抗體。

1.8 Transwell遷移和侵襲實驗

細胞遷移實驗取對數生長期的細胞（1×105）接種于未鋪Matrigel膠的小室，500 μL的完全培養基（10%胎牛血清）加入下室；在37℃、5% CO2的培養箱中孵育24 h后取出小室，加入4%多聚甲醛固定細胞15 min，使用棉簽棒擦拭上室中未穿膜細胞；倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野的細胞計數，取均數。

細胞侵襲實驗取對數生長期的細胞（1×105）接種于預先鋪有25 μL的Matrigel 膠小室，其余步驟與遷移實驗一致。使用棉簽棒擦拭上室中未穿膜細胞；倒置顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野的細胞計數，取均數。

1.9 統計學處理

采用 SPSS 17.0 統計軟件分析。計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，P<0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌患者臨床病理指標

剔除拒絕入組及不符合入組條件者，本實驗入組114例確診的HCC患者，年齡范圍為48～82歲（中位數為67歲），年齡為（47.22±15.36）歲，男性為（46.57±11.69）歲，女性為（48.25±19.10）歲；男性76人（66.7%），女性38人（33.3%）。其中，非吸煙患者占（27人）23.7%，吸煙患者占（87人）76.3%。根據肝細胞癌的TNM 分期，患者病理腫瘤分期的分布為Ⅰ期15例，Ⅱ期39例，Ⅲ期51例，Ⅳ期9例（表2）。

表2 肝細胞癌患者病理特征

2.2 HCA587的表達

應用RT-PCR法研究肝細胞癌患者HCA587基因的轉錄水平表達，選擇肝細胞癌組織及匹配的癌旁非腫瘤組織。結果顯示，與癌旁非癌組織組比，肝細胞癌組織中HCA587的mRNA高水平表達，差異有統計學意義（P<0.05，圖1A、B）。

圖1 HCA587 mRNA的表達。

2.3 肝細胞癌組織中HCA587翻譯水平和表達變化

HCA587在肝細胞癌組織中的蛋白表達檢測，免疫印跡檢測結果與RT-qPCR結果一致，與癌旁非癌組織組比，肝細胞癌組織中HCA587的蛋白水平上調，差異均有統計學意義（圖2A）。免疫組織化學結果顯示，肝細胞癌組中的HCA587陽性率高于癌旁非癌組織（圖2B）。

圖2 HCA587在肝細胞癌中的表達。

2.4 HCA587啟動子區甲基化水平

NT組及HCC組基因HCA587基因啟動子區CpG島甲基化水平分布圖見圖3，HCC組HCA587啟動子區CpG島平均甲基化率為（15.61±6.85）%，NT組平均甲基化率為（19.89±5.22）%，HCC組HCA587基因啟動子區CpG島的甲基化水平較NT組低，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖3 HCA587基因啟動子區甲基化檢測結果，HCA587基因啟動子區CpG島甲基化水平分布圖.

2.5 5-Azacytidine抑制HCA587的甲基化，并促進HCA587的mRNA表達

使用5-Azacytidine處理HCC細胞后發現，HCA587的 mRNA表達較對照組顯著增加（表3，P<0.05）；但是，HCA587的甲基化水平較對照組顯著降低（表3，P<0.05）。

表3 5-Azacytidine 對HCC細胞中HCA587的mRNA和甲基化水平影響（n=3，±s）

表3 5-Azacytidine 對HCC細胞中HCA587的mRNA和甲基化水平影響（n=3，±s）

*P<0.05 vs對照組

組別 HCA587 mRNA HCA587甲基化對照組 2.669±0.547 1.000±0.012 5-Azacytidine 12.536±2.997* 0.651±0.324*

2.6 5-Azacytidine 促進HCA587和TAF9的結合

使用5-Azacytidine處理肝細胞癌細胞。使用免疫沉淀法研究細胞中HCA587和TAF9的直接作用。免疫印跡檢測結果表明，與5-Azacytidine處理前比，HCA587和TAF9的免疫沉淀復合物增加（圖4A、B）。結果表明，肝細胞癌細胞中5-Azacytidine可促進HCA587和TAF9的結合。

圖4 5-Azacytidine 處理肝細胞癌細胞后，使用免疫沉淀技術檢測HCA587和TAF9的結合。IP：免疫沉淀。

2.7 5-Azacytidine或過表達HCA587上調HCC細胞的遷移和侵襲

進一步檢測5-Azacytidine及pcDNA3.1-HCA587處理肝細胞癌細胞對細胞遷移和侵襲的影響（圖5A、B），與對照組比，5-Azacytidine促進肝細胞癌細胞的遷移細胞數量和侵襲細胞數量，差異均有統計學意義（P<0.018）（圖5A、B），過表達HCA587促進肝細胞癌細胞的遷移和侵襲能力，與空載體組比，pcDNA3.1-HCA587組的遷移細胞數和侵襲細胞數明顯增多，差異有統計學意義（P<0.05）。

圖5 Twanswell小室法檢測過表達HCA587對HCC細胞侵襲細胞數的影響。A1～E1：Transwell細胞遷移結果（A1～D1）及遷移細胞數統計柱形圖（E1），標尺=20μm；A2～E2：Transwell細胞侵襲結果（A2～D2）及侵襲細胞數統計柱形圖（E2），標尺=20 μm。*P<0.05 vs對照組；#P<0.05 vs 空載體組。

3 討論

肝細胞癌是五大最常見的癌癥類型之一，具有高復發率，缺乏有效的化療和放療手段[10]，多種致癌信號通路的失調是肝細胞癌的關鍵特征，本研究認為這些失調的信號機制中可能也包括HCA587啟動子區甲基化改變和HCA587/MAGE-C2-TAF9信號調節機制。

HCA587/MAGEC2是一種腫瘤-睪丸（cancer testis，CT）抗原，在多種惡性腫瘤中表達，包括肝細胞癌、黑素瘤、膀胱癌、頭頸癌、乳腺癌和肺癌[11]。先前的研究主要集中在確定HCA587/MAGEC2作為腫瘤免疫治療靶標的潛力；且已證明HCA587/MAGEC2具有免疫原性，可在患有HCA587/MAGEC2表達的腫瘤患者中誘發自發性抗體和T細胞免疫反應[7，12-13]。而且先前的研究表明，HCA587/MAGEC2在癌細胞中的表達可能介導腫瘤細胞的轉移潛能[14-16]。肝細胞癌等惡性腫瘤的轉移是預后差的關鍵原因，先前的報道表明HCA587/MAGEC2還可通過與信號轉導與轉錄激活因子3（signal transduction and transcriptional activator 3，STAT3）結合來促進腫瘤轉移[16]，這與本研究結果相似。本研究結果顯示，肝細胞癌細胞中過表達HCA587后，細胞的體外遷移和侵襲能力均明顯上調，意味著HCA587可能是促進肝細胞癌轉移的關鍵抗原之一。

本研究結果表明，肝細胞癌細胞中TAF9能明顯與HCA587/MAGEC2進行結合，該結果與先前的研究一致，TAF9是HCA587/MAGEC2的結合伴侶。TAF9和HCA587/MAGEC2共定位于細胞核中，而且通過免疫沉淀試驗證明了HCA587/MAGEC2與TAF9在腫瘤細胞內的內源性相互作用[6]，TAF9是一種具有調節轉錄延伸調控因子和細胞周期控制關鍵基因的基因，介導G1/S周期過渡、細胞極性、細胞完整性[17]。因此，HCA587與TAF9相互作用可能與腫瘤細胞的生長和侵襲能力有重要關聯。Nault等[18]報道，TAF9表達上調與通過切除術治療的肝細胞癌患者預后差有關。此外，還證明了TAF9與鋅指蛋白Gli相互作用并調節Gli活性，用干擾Gli/TAF9相互作用的抑制劑治療可抑制腫瘤生長[19]。在本研究中，再次證實了TAF9與HCA587/MAGEC2的結合，肝細胞癌細胞中TAF9與HCA587/MAGEC2的結合可能對腫瘤細胞的生長、周期、轉移等具有調節作用，但是仍需進一步通過實驗證實。

表觀遺傳學是基于基因表達水平的信息遺傳，而腫瘤已被確定為表觀遺傳疾病[20]。近年來研究證實，表觀遺傳變化引起染色體失去穩定性、基因非法表達、非整倍性和突變，這些均可導致抑癌基因的轉錄沉默[21]。在人類基因組中，CpG二核苷酸不協調地分布形成了富含CpG的區域。CpG島異常甲基化是常見的表觀遺傳修飾，這是組織特異性而非物種特異性。DNA甲基化對多種細胞功能具有一定影響，比如細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移。本研究結果顯示，人類肝細胞癌中的HCA587的DNA啟動子區的甲基化出現異常，研究表明包括HCA587在內的多個基因腫瘤中以高表達和低甲基化狀態存在，并通過轉錄激活促進腫瘤的進展[22]。因此，推測HCA587的低甲基化和高表達在肝細胞癌中具有關鍵調節作用。本實驗結果與推測的一致，觀察的肝細胞癌患者腫瘤組織中HCA587的表達大范圍上調，而且通過免疫印跡和免疫組織化學法驗證了患者組織中HCA587高表達。通過研究HCA587的表觀遺傳調控和功能，顯示HCA587在人肝細胞癌樣本中表達水平較高，且甲基化水平較低，體外證實HCA587的高表達受啟動子區域甲基化的調節。這些數據表明，HCA587的低甲基化和高表達可作為肝細胞癌早期檢測標記；另外，在體外使用甲基化抑制劑5-Azacytidine后，肝細胞癌細胞的遷移和侵襲能力明顯增加。為了驗證甲基化抑制后對HCA587功能的影響，觀察了5-Azacytidine對HCA587表達的影響，結果顯示HCA587的mRNA水平明顯增加，而體外使用pcDNA3.1重組質粒過表達HCA587后，同樣增加了肝細胞癌細胞的遷移和侵襲能力，表明HCA587的CpG區甲基化改變對人類肝細胞癌的轉移可能具有重要意義。

本研究仍有稍許不足，首先樣本量仍需進一步擴大，明確HCA587的甲基化在肝細胞癌不同分期中的變化，在體內分析HCA587的表達和甲基化水平與患者5年生存期的相關性；另外，仍需進一步明確TAF9與HCA587/MAGEC2結合可能對腫瘤細胞的生長、周期、轉移等影響。

綜上所述，本研究目前的工作表明，HCA587基因在肝細胞癌中具有高表達和低甲基化趨勢。而且，HCA587表達和甲基化水平改變是調節肝細胞癌轉移的關鍵機制之一。本研究為肝細胞癌的治療靶點研究提供了有價值的實驗基礎。