p53和DNA損傷調節基因1在口腔癌組織中的表達及通過Wnt/β-catenin信號途徑對口腔癌細胞自噬和凋亡的影響*

董慶旭 趙鄭莉

（河南省第二人民醫院口腔科，鄭州 451100）

口腔癌占全部惡性腫瘤的1.9%～3.5%，頭頸癌的4%～20%，發病率僅低于鼻咽癌[1]。目前，針對口腔癌的治療方法與其他癌癥類似，包括基因、免疫和腫瘤干細胞等新型治療方法，但是療效尚不能令人滿意[2]。因此，進一步明確定口腔癌治療靶標對于開發特異性分子靶向藥物和評估口腔癌的預后至關重要。p53和DNA損傷調節基因1（p53 and DNA damage regulated gene 1，PDRG1）與各種細胞生理活動密切相關，包括細胞增殖、生長、凋亡、細胞周期調節和DNA損傷修復[3]。研究表明，PDRG1可作為致癌分子，例如，PDRG1在大腸癌組織和胃癌組織中高表達，同時在結腸癌的細胞中沉默PDRG1會影響癌細胞的生長[4]。Tao等[5]研究表明PDRG1可能通過介導ATM-p53信號通路來影響肺癌細胞的生長和放射敏感性。但PDRG1是否在口腔癌中表達和發揮功能尚不清楚。 因此，本研究檢測了PDRG1在口腔癌組織及口腔癌細胞系中的表達，同時觀察沉默PDRG1對口腔癌細胞增殖、自噬及凋亡的影響，為PDRG1在口腔癌進展中的作用及其作為新的治療靶標提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 臨床組織

收集2017年6月至2019年6月在河南省第二人民醫院60例接受口腔癌切除手術的患者的癌組織標本及配對的癌旁組織，其中男性30例，女性30例；年 齡35～68歲，平均（53.21±5.34）歲。納入標準：（1）符合2010年口腔頜面部惡性腫瘤治療指南，經病理診斷確定為口腔癌（不受癌癥分期及組織學類型限制）；（2）術前未接受抗腫瘤治療，無其他部位惡性腫瘤，無認知功能障礙。所有患者術前均簽署了知情同意書。所有組織標本都保存在-80℃直至使用。

1.2 細胞和主要試劑

正常人口腔角質形成細胞（NHOK）和口腔癌細胞系（SCC-4，SCC-25，SCC-15，SCC-9）購自中國科學院上海細胞生物學研究所。DMEM培養基和胎牛血清（美國Gibco公司）；TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqⅡ試劑盒（日本TaKaRa公司）；shNC和shPDRG1質粒（上海吉瑪制藥技術有限公司）；LipofectamineTM3000（美國Invitrogen公司）；Annexin V/PI試劑盒、RIPA裂解液、BCA試劑盒、PDRG1抗體（美國Abcam公司）；β-catenin抗體、c-myc抗體、cyclin D1抗體、GAPDH抗體、IgG-HRP抗體（美國Cell Signaling Technology公司）。

1.3 細胞培養和轉染

NHOK細胞、SCC-4細胞、SCC-25細胞、SCC-15細胞和SCC-9細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2的培養箱中培養，2 d更換1次培養基。

SCC-15細胞按照1×105個/孔接種在24孔板中，隨機分為shNC組（轉染shNC質粒）和shPDRG1組（轉染shPDRG1質粒）。待細胞生長融合至60%時，按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行轉染，其中shNC和shPDRG1的轉染終濃度為50 nmol/L。在37℃、5% CO2的培養箱中培養6 h后，更換新鮮的培養基繼續培養。48 h后結束培養，收集各組細胞進行后續實驗。

1.4 細胞集落形成實驗檢測細胞增殖

培養結束后的各組細胞經胰酶消化以5×102個/孔接種于6 cm細胞培養皿中。14 d后，用4%多聚甲醛固定并用0.1%結晶紫染色，計數含有≥50個細胞的集落，顯微鏡拍攝代表性集落并統計。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

培養結束后的各組細胞，離心并重懸于緩沖液中。細胞依次Annexin V溶液10 μL和PI溶液10 μL染色，之后將細胞在室溫下黑暗環境中孵育30 min，然后使用FACSCalibur流式細胞儀進行分析。

1.6 電鏡觀察細胞自噬體的數量

各組細胞培養結束后吸去上清，PBS洗滌，加入2.5%戊二醛固定過夜，再加入1%鋨酸后固定2 h，依次用50%、70%、90%、100%的丙酮脫水，包埋、染色后，用透射電子顯微鏡觀察細胞自噬體的數量。

1.7 qRT-PCR檢測PDRG1的mRNA水平

TRIzol試劑提取組織樣本或細胞中的總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA濃度。使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒將提取的RNA逆轉錄成cDNA；使用SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒進行qRT-PCR。使用StepOnePlus實時PCR系統完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數據。所用引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物

1.8 免疫印跡檢測PDRG1、LC3A/B 、β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白

RIPA裂解液提取組織樣本或者細胞中的總蛋白，通過BCA法測定總蛋白含量，并將配對的樣品調節至相同濃度。樣品經變性后，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后將PVDF膜分別與以下抗體在4℃孵育過夜：PDRG1抗體（1∶1 000）、LC3A/B 抗體（1∶1 000）、β-catenin抗體（1∶1 000）、c-Myc抗體（1∶1 000）、cyclin D1抗體（1∶1 000）和GAPDH抗體（1∶2 000）。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，并與IgG-HRP抗體（1∶4 000）孵育1 h，TBST洗滌3次。最后顯影曝光，Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.9 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行，正態分布數據資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗，率的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 PDRG1在口腔癌組織和口腔癌細胞系中的表達

qRT-PCR結果顯示，與癌旁正常組織相比，PDRG1 mRNA在口腔癌組織中表達增加（P<0.01，圖1A）；與NHOK組細胞相比，PDRG1 mRNA在口腔癌細胞系中的表達明顯增加（P<0.01，圖1C）。免疫印跡檢測結果顯示，與癌旁正常組織相比，口腔癌組織中PDRG1蛋白表達水平上調（P<0.01，圖1B）；與NHOK組相比，PDRG1蛋白在口腔癌細胞系中表達明顯上調（P<0.01），其中SCC-15細胞中PDRG1的表達水平最高（P<0.01，圖1D），因此后續實驗選擇SCC-15細胞。

2.2 在SCC-15細胞中沉默PDRG1

與shNC組相比，shPDRG1組SCC-15細胞中PDRG1 mRNA的表達顯著下降（P<0.01，圖1A），PDRG1蛋白的表達水平明顯下調（P<0.01，圖1B）。

圖1 PDRG1在口腔癌組織和口腔癌細胞系中的表達

圖2 沉默PDRG1在SCC-15細胞中的表達

2.3 沉默PDRG1對SCC-15細胞增殖能力的影響

細胞集落形成實驗結果顯示（圖3）：與shNC組相比，shPDRG1組SCC-15細胞的集落數目明顯減少（P<0.01）。

圖3 沉默PDRG1對SCC-15細胞增殖能力的影響

2.4 沉默PDRG1對SCC-15細胞自噬的影響

免疫印跡結果顯示（圖4A）：與shNC組相比，shPDRG1組細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例減少（P<0.01）；電鏡結果顯示（圖4B）：與shNC組比較，shPDRG1組細胞中自噬體數量減少。

圖4 沉默PDRG1對SCC-15細胞自噬的影響

2.5 沉默PDRG1對SCC-15細胞凋亡率的影響

細胞流式術結果顯示（圖5）：與shNC組相比，shPDRG1組SCC-15細胞的凋亡率明顯提高（P<0.01）。

2.6 沉默PDRG1對Wnt/β-catenin信號途徑的影響

免疫印跡結果顯示，與shNC相比，shPDRG1組SCC-15細胞中β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表達水平下調（P<0.01）（圖5）。

圖5 沉默PDRG1對SCC-15細胞凋亡率的影響

圖6 沉默PDRG1對Wnt/β-catenin信號途徑的影響

3 討論

口腔癌是頭頸部腫瘤中常見的惡性腫瘤，是口腔內發生的惡性腫瘤之一，也是預后差的惡性腫瘤之一[6]。盡管口腔癌的預后和治療方面取得了巨大進步，但該癌癥的5年生存率仍低于63%[7]。研究表明，男性患口腔癌的幾率比女性高，其原因可能是男性吸煙或酗酒史的人群所占的百分比較高。目前，針對口腔癌的治療方法與其他癌癥類似，主要包括手術切除、放療、化學療法或中藥治療，但是尚未達到令人滿意的療效。因此，迫切需要找到新的鑒定口腔癌標志物并探索口腔癌治療的新策略。

PDRG1位于20號染色體的長臂上，編碼存在于細胞質中不同亞細胞區室的133個氨基酸的蛋白質[8]。研究表明，PDRG1在多種惡性腫瘤中的表達均高于正常組織，比如結腸癌、直腸癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和子宮癌等[4]。Zhang等[9]研究表明PDRG1基因沉默可能通過激活ATM/p53途徑抑制胃癌細胞的生長和轉移。Wang等[8]研究表明，miR-214可以下調癌基因PDRG1從而在膀胱癌中發揮腫瘤抑制作用，并為膀胱癌的預后和治療干預提供了新指標。我們的實驗數據表明，PDRG1在口腔癌組織和口腔癌細胞系中高表達，接著我們構建了PDRG1低表達的穩定SCC-15細胞株，發現沉默PDRG1使SCC-15細胞的增殖能力下降，表明沉默PDRG1可抑制SCC-15細胞的活力。

自噬是一個吞噬自身細胞質蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物的過程，借此實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新，維持機體內環境穩定[10]。Lin等[11]研究表明，熊果酸能抑制自噬、誘導凋亡和抑制遷移從而在口腔癌細胞中發揮抗增殖作用；Wang等[12]研究發現，乙酰紫草素通過誘導自噬、程序性細胞死亡和靶向m-TOR/PI3K/Akt信號通路來抑制順鉑耐藥的口腔癌細胞的體內外腫瘤發生。然而PDRG1在口腔癌細胞自噬中研究甚少，因此，本實驗進行了進一步研究。結果發現，沉默PDRG1明顯抑制SCC-15細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達比例的下調，減少SCC-15細胞中自噬體數量，表明沉默PDRG1對SCC-15細胞自噬有抑制作用。

細胞凋亡也稱為"固縮壞死"、"程序性細胞死亡"或"細胞自殺"，是由基因介導的一系列變化[13]。凋亡最初由特征性的形態變化來確定，包括：DNA的程序性降解、染色質濃縮、細胞縮小和碎裂。它可以是生理性的，或由化療藥物及放射誘發。Li等[14]研究表明，沉默miR-155可上調Foxo3a表達，從而抑制口腔癌細胞增殖、促進細胞凋亡，并增強口腔癌細胞中的DDP敏感性。因此，本實驗也檢測了沉默PDRG1對SCC-15細胞凋亡率的影響，結果表明，沉默PDRG1明顯促進SCC-15細胞的凋亡率，但是具體的機制有待進一步研究。

Wnt/β-catenin信號通路是一種高度保守的分子機制，在形態發生、基因轉錄、分化和增殖的發育中起關鍵作用[15]。研究發現Wnt/β-catenin信號通路在各種類型的腫瘤和癌癥中均被異常激活[16]，可能通過調節其下游靶標如cyclin D1，c-Myc，GSK-3等因子參與調控。此外，Wnt/β-catenin信號通路活性的改變與細胞自噬和凋亡有關[17]。近幾年在口腔癌細胞中發現了β-catenin的轉錄活性上調[18]。但是PDRG1是否通過Wnt/β-catenin信號通路在口腔癌細胞中發揮作用尚未報道。因此，本研究結果顯示，沉默PDRG1使SCC-15細胞中的β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白水平降低。上述結果表明，PDRG1可能通過調節Wnt/β-catenin信號通路在口腔癌中發揮作用。

綜上所述，PDRG1在口腔癌組織和口腔癌細胞系中高表達。沉默PDRG1可以抑制SCC-15細胞的增殖與自噬，并促進SCC-15細胞凋亡，而且抑制Wnt/β-catenin信號途徑的激活。因此，PDRG1具有作為口腔癌診斷生物標志物的潛在價值，也可能成為口腔癌治療的希望靶標。