高效液相色譜法同時測定五蟲化瘀通絡膠囊中3 種活性成分

榮娟娟 祁 俊 韓曉珂 徐 斌 陳 娟 王 權

安徽省蕪湖市中醫醫院制劑室，安徽蕪湖 241000

五蟲化瘀通絡膠囊（皖藥制字Z20100005）是安徽省蕪湖市中醫醫院（以下簡稱“我院”）專家經驗方，主要由當歸、川芎、丹參、地龍、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、水蛭等多味中藥組成。具有活血化瘀、通絡止痛的功效，經過老中醫多年的臨床驗證，其療效可靠。主要用于治療瘀血阻滯所致的缺血性股骨頭壞死，骨折后疼痛，活動不利、骨不愈合等癥[1-8]。原有的高效液相色譜法含量測定標準僅以丹酚酸B 定量控制五蟲化瘀通絡膠囊的質量，測定指標較單一。為了更好地進行質量控制，需要制訂更加合理的含量測定方法，本研究通過高效液相色譜法同時測定五蟲化瘀通絡膠囊中阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 3 種指標成分[9-10]，用于監控五蟲化瘀通絡膠囊的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，型號：Agi lent 1200 型）；萬分之一電子天平（Mettler 公司，型號：XP-205）；數控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-500DB）；數顯鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠，型號：GZX-9140MBE）。

1.2 試藥

阿魏酸對照品（批號：110773-201614，純度99.0%），丹酚酸B 對照品（批號：111562-201716，純度94.1%），丹參酮ⅡA 對照品（批號：110766-201721，純度99.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈（TEDIA Company，色譜級）；甲醇（TEDIA Company，色譜級）；磷酸（上海展云化工有限公司，色譜級）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動相，進行梯度洗脫（0～8 min，22%A；9～19 min，26%A；20～34 min，80%A；35～40 min，22%A）；柱溫：20℃；流速：1.0 ml/min；檢測波長：0～21 min 為286 nm（檢測阿魏酸和丹酚酸B），21～40 min 為270 nm（檢測丹參酮ⅡA）；進樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸對照品、丹酚酸B 對照品和丹參酮ⅡA 對照品適量，加入甲醇制成濃度分別是10.56、219.06、6.52 μg/ml 的混合對照品儲備液。精密吸取混合對照品儲備液3 ml，同時放于10 ml 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成含阿魏酸3.17 μg/ml、丹酚酸B 65.72 μg/ml 和丹參酮ⅡA 1.96 μg/ml 的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取五蟲化瘀通絡膠囊（批號：201110）20 粒，倒出內容物，混合，研細，精密稱量約0.5 g，置于刻度為150 ml 的具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 ml，蓋上玻璃塞，用封口膜封緊，稱定其重量，置超聲儀（350 W，40 kHz）中超聲處理30 min，放冷至室溫，稱定其重量，再用75%的甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方配比稱取除當歸、川芎和丹參飲片以外的其他飲片，按照五蟲化瘀通絡膠囊制備工藝及供試品溶液的制備方法配制成缺味當歸、川芎和丹參的陰性樣品溶液。

2.3 方法專屬性考察

精密吸取上述3 種溶液各10 μl，依法測定。結果顯示阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 與樣品中其他組分的分離度良好，陰性樣品色譜峰在相應位置未檢出，其專屬性良好。見圖1。

圖1 五蟲化瘀通絡膠囊色譜圖

2.4 線性關系考察

取混合對照品儲備溶液，精密吸取5 ml，同時放于10 ml 的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成含阿魏酸5.28 μg/ml、丹酚酸B 109.53 μg/ml 和丹參酮ⅡA 3.26 μg/ml 的混合對照品溶液，各精密吸取1、2、4、6、8、10 μl，分別進樣測定，以樣品濃度為橫坐標（X），色譜峰的出峰面積為縱坐標（Y），進行曲線擬合。得到阿魏酸的回歸方程為Y=44.592X-1.6293，R2=0.9999，表明在0.528～5.280 μg/ml 范圍內，阿魏酸對照品線性關系良好。得到丹酚酸B 的回歸方程為Y=11.421X+14.434，R2=0.9996，表明在10.953～109.530 μg/ml 范圍內，丹酚酸B 對照品線性關系良好。得到丹參酮ⅡA 的回歸方程為Y=63.063X-3.8696，R2=0.9994，表明在0.326～3.260 μg/ml 范圍內，丹參酮ⅡA 對照品線性關系良好。

2.5 精密度試驗

連續進樣上述混合對照品溶液6 次，每次10 μl，分別記錄阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的峰面積，計算得阿魏酸峰面積的RSD 為0.58%，丹酚酸B 峰面積的RSD 為0.64%，丹參酮ⅡA 峰面積的RSD 為0.78%。

2.6 重復性試驗

取同一批五蟲化瘀通絡膠囊（批號：201110），按“2.2.2”項下方法，精密稱定后分別配制成6 份供試品溶液，再精密吸取各10 μl 的混合對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀，分別測定。計算得阿魏酸含量的RSD 為1.77%；丹酚酸B 含量的RSD 為0.88%；丹參酮ⅡA 含量的RSD 為0.91%。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液，精密吸取10 μl，在配制好后的第0、2、4、6、8、10 h 分別進樣1 次，測得峰面積積分值。計算阿魏酸峰面積的RSD 為0.41%，丹酚酸B 峰面積的RSD 為0.21%，丹參酮ⅡA 峰面積的RSD 為0.38%，結果顯示供試品溶液測定在10 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收試驗

采取加樣回收法，取已知含量的五蟲化瘀通絡膠囊內容物（批號：201110）9 份，每份約0.25 g，精密稱定，分別放于50 ml 的容量瓶中，分別精密加阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 對照品適量，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定膠囊含量并計算加樣回收率。見表1。

表1 阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 加樣回收試驗結果

2.9 樣品含量測定

分別精密稱量201110、201119、201126 三批五蟲化瘀通絡膠囊樣品各約0.5 g，依照五蟲化瘀通絡膠囊含量測定法進行測定，計算樣品中阿魏酸、丹酚酸B和丹參酮ⅡA 含量。見表2。

表2 三批樣品含量測定結果（mg/g）

3 討論

五蟲化瘀通絡膠囊是中藥復方制劑，由多味中藥組成，療效確切，為了更好地控制院內制劑的質量，需要對我院制劑的質量標準進行提高和完善。當歸、川芎藥材中所含的阿魏酸成分，具有活血行氣、祛風止痛的功效，現代藥理顯示其具有抗血小板聚集、緩解血管痙攣等作用[11-14]。丹參的主要藥效成分丹酚酸B，具有活血祛瘀、通經活絡、涼血消腫的功效[15-16]。丹參酮ⅡA 具有保護血管內皮、改善微循環、抗炎、抗感染等多種藥理作用，可以減輕炎癥反應，提高機體免疫能力[17-18]。故本研究選擇了阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 3 種活性成分進行含量測定。

參考相關文獻報道及《中華人民共和國藥典》，確定了阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的最大吸收波長分別為286、321、270 nm，結合丹參是本制劑品種的君藥成分，故僅選取286、270 nm 作為檢測波長[19-22]。高效液相色譜法測定中藥制劑中的阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 常采用乙腈-磷酸水、乙腈-甲酸水等流動相進行檢測[23-26]，因此，本研究考察了乙腈、磷酸水、甲酸水幾個不同組合，經過比對選取乙腈-0.1%磷酸作為流動相進行梯度洗脫。

本研究通過高效液相色譜法同時測定五蟲化瘀通絡膠囊中阿魏酸、丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 3 種指標成分，結果表明該方法穩定可靠、靈敏度高，可用于五蟲化瘀通絡膠囊的質量控制。