LncRNA PiHL在奧沙利鉑耐藥結直腸癌細胞中的作用及初步機制

李思，田思雨，袁宏

(1.大連醫科大學附屬第一醫院檢驗科，遼寧大連116011；2.大連醫科大學檢驗醫學院，遼寧大連 116044；3.大連市中心醫院檢驗科，遼寧大連 116089)

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)作為目前世界上第三位常見癌癥，每年全球范圍內約有140萬例新增病例以及超過60萬的死亡病例[1]。目前，奧沙利鉑與5-氟尿嘧啶(5-FU)和亞葉酸(FOLFOX)聯合化療方案在轉移性結直腸癌中的緩解率僅為50%[2]?；熁颊甙l生轉移和產生化療耐藥性仍然是結直腸癌治療的關鍵障礙。研究表明，LncRNA在癌癥的發生和轉移中起著重要作用，多種異常表達的LncRNA可作為癌基因或抑癌基因發揮重要功能[3]。最近的研究發現，LncRNA表達失調與結直腸癌的化學耐藥有關[4]。目前研究表明，LncRNA主要通過多種機制介導癌癥耐藥，包括限制藥物在細胞內的積累[5]，增加DNA損傷修復[6]等。LncRNA PiHL是定位于核內的LncRNA，在結直腸癌中的表達水平顯著上調，且PiHL的表達與結直腸癌腫瘤體積和患者預后相關。但是PiHL在結直腸癌耐藥中的具體功能和作用機制仍不清楚。為了進一步明確PiHL在結直腸癌化療耐藥中的關鍵作用，本課題組構建了結直腸癌奧沙利鉑耐藥細胞系，確定了PiHL在耐藥細胞系中呈高表達；通過體外生物學實驗證實結直腸癌細胞中PiHL的表達水平對奧沙利鉑作用的影響；并探討PiHL通過與多梳抑制復合物結合介導奧沙利鉑的耐藥，初步闡明其機理。報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞系、試劑與儀器 人結直腸癌細胞系SW620、SW480、DLD1、HCT116和人胚腎上皮細胞HEK293T均購自中國科學院上海生命科學院研究所。DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，引物均購自大連寶生物公司，奧沙利鉑(美國MCE公司)，慢病毒(上海杰李公司)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(日本TaKaRa公司)，FastStart Universal SYBR Green Master(Rox，瑞士Roche公司)，RNAmax T7體外轉錄試劑盒(廣州銳博生物公司)；Lipofectamine 3000轉染試劑(美國Thermo Fisher公司)。Applied Biosystems 7500 實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Multiskan GO全波長酶標儀(美國Thermo Fisher公司)，水平電泳儀(上海天能科技公司)，流式細胞儀(美國Beckman公司)，NanoDrop微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2細胞毒性實驗 取對數生長期的上述細胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化，鋪于96孔細胞培養板中(1 000個/孔)，第2天加入含奧沙利鉑培養基處理，分別設置對照組(加入0.5%DMSO)、空白組(無細胞)及加藥組(不同細胞的加藥濃度不同，根據細胞的IC50確定)。置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養5 d，加入不含血清培養基的CCK8試劑(每孔100 μL，1∶10稀釋)，37 ℃培養箱溫育1～2 h，于450 nm波長下檢測吸光度A值，并計算各組存活率。

1.3奧沙利鉑耐藥細胞系的構建 取處于對數生長期且狀態良好的結直腸癌細胞HCT116、DLD1、SW480、SW620，用含(初濃度為0.1 μmol/L)奧沙利鉑的DMEM培養基接種于培養皿中常規培養。當細胞能維持正常生長且存活率大于50%時，根據不同細胞的存活狀況提高藥物濃度，反復誘導，直至細胞能夠在含一定濃度的奧沙利鉑和10%胎牛血清的DMEM培養基中正常生長，細胞存活率與正常細胞無顯著差異。

1.4構建穩定過表達PiHL結直腸癌細胞系和穩定干擾PiHL結直腸癌細胞系 構建PiHL過表達質粒和包含PiHL靶向序列的shRNA，按照Lipofectamine 3000轉染試劑說明書配制病毒包裝體系(即病毒包裝)。向含待轉染且處于對數生長期的結直腸癌細胞的6孔細胞培養板中加入1.5 mL新培養基及500 μL病毒液(室溫融化)，加入2 μL polybrene轉染試劑，培養48 h后用 0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選并繼續培養穩轉株。

1.5流式細胞術測定細胞凋亡 取對數生長期且未經處理的結直腸癌細胞(對照組)和干擾PIHL表達的結直腸癌細胞(實驗組)接種于6孔細胞培養板內，第2天更換新的培養液并加入奧沙利鉑作用24 h，使用無EDTA的胰蛋白酶消化，收集細胞并用PBS洗滌；加入緩沖液、Annexin V以及FITC PI染液，室溫避光溫育15 min；設置未染色、Annexin V單染、PI單染作為空白對照。采用流式細胞儀檢測，計數20 000個細胞，使用Flowjo軟件分析細胞凋亡情況。

1.6實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測 收集上述對數生長期細胞，Trizol試劑提取細胞中的總RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，樣本置于-20 ℃保存，提取的RNA/DNA使用Nandrop2000微量分光光度計測定濃度和純度，選取吸光度比值(A260 nm/A280 nm)在1.8～2.0之間的樣本用于后續實驗。PCR總反應體積為 20 μL，包括：TBGreenPremix Ex TaqⅡ(2×)10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，滅菌水6.4 μL。循環參數：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，56 ℃ 20 s,共40個循環。在56 ℃時收集每個循環的熒光信號，進行熔解曲線分析。采用儀器自帶軟件分析擴增曲線和熔解曲線中的熒光信號，并計算平均閾值循環數(Ct值)。以β-actin作為內參，通過2-ΔΔCt法計算待測基因的相對表達量。

1.7western blot檢測PiHL過表達和干擾后EZH2的表達變化 使用慢病毒作為載體,構建穩定過表達PiHL的DLD1、HCT116細胞及其陰性對照(NC組)，穩定干擾PiHL的DLD1-oxa、HCT116-oxa細胞及其陰性對照組。將細胞分別接種于6孔細胞培養板中，當細胞融合度達90%、單孔細胞總數不少于106個時，收集細胞，用預冷的PBS洗滌并用RIPA緩沖液裂解。使用BCA試劑盒測定細胞裂解液中的蛋白質水平，用含10% SDS的PAGE電泳分離總蛋白質，使用濕轉轉膜儀調節穩定電流為300 mA，根據所要檢測蛋白質分子量大小設置轉膜時間。用含5%BSA的TBST封閉PVDF膜，室溫搖床振蕩溫育2 h。再次用TBST充分洗滌后，加入兔抗anti-EZH2多克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃搖床溫育過夜。加入辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔抗體anti-IgG(1∶1 000稀釋)室溫搖床振蕩反應2 h。使用ECL顯色試劑在避光環境中顯影，掃描成像后采用Image J軟件對目的條帶進行灰度分析。

1.8RNA pull-down試驗檢測PiHL與EZH2蛋白的結合 利用T7 RNA合成酶識別序列合成引物，以cDNA為模板擴增出攜帶T7 RNA合成酶識別序列的PiHL全長DNA產物，進行體外轉錄，去除cDNA模板并對產物純化后得到LncRNA PiHL并標記上生物素，將PiHL與結直腸癌細胞HCT116的細胞核裂解液反應，并用親和素標記的磁珠將PiHL結合的蛋白質復合體進行純化，用EZH2抗體進行western blot。

1.9統計學分析 使用SPSS 23.0統計軟件分析，圖表繪制使用Graphpad 8.0軟件；實驗組與對照組差異的比較采用配對t檢驗。Spearman檢驗進行相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1PiHL在4種奧沙利鉑耐藥結直腸癌細胞系中的表達水平 所構建的耐藥細胞系對奧沙利鉑產生顯著穩定的耐藥性(圖1)，奧沙利鉑在不同細胞的IC50值見表1。進一步通過qRT-PCR檢測HCT116、DLD1、SW620、SW480結直腸癌細胞和其對應耐藥細胞系中PiHL的表達水平，結果發現耐藥細胞系PiHL的表達水平較親本細胞均顯著升高，差異具有統計學意義。見圖2。

圖1 CCK8法檢測結直腸癌親本和耐藥細胞系奧沙利鉑敏感性

表1 奧沙利鉑在不同細胞中的IC50值(μmol/L)

注：與對照組相比，**，P<0.01。

2.2PiHL促進結直腸癌細胞對奧沙利鉑耐藥 CCK8法結果顯示，在HCT116、DLD1、SW480細胞中，PiHL基因被穩定過表達后，在相同濃度奧沙利鉑作用下細胞的存活率均顯著高于對照組(圖3)，流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，過表達PiHL組奧沙利鉑誘導的細胞凋亡比例較對照組明顯減少(圖4)，細胞系對奧沙利鉑敏感性明顯降低。在耐藥結直腸癌細胞系中，奧沙利鉑作用下shRNA PiHL1和shRNA PiHL組細胞存活率明顯低于對照組，并且細胞凋亡比例明顯增加。見圖5、6。

注：與對照組相比，*，P<0.05。

注：與對照組相比，*，P<0.05。

注：與對照組相比，*，P<0.05；**，P<0.01。

注：與對照組相比，*，P<0.05；**，P<0.01。

2.3PiHL通過與EZH2結合對CDKN2B/RUNX3/KLF家族基因進行表觀遺傳抑制 對TCGA數據庫結直腸癌組織樣本進行分析發現,PiHL的表達和PRC2的組成成分EZH2、SUZ12、EED的表達呈顯著正相關(圖7)。RNA pull-down試驗和western blot驗證PiHL與多梳抑制復合物作用的結果如圖8所示，RNA PiHL可以與EZH2蛋白結合，且PiHL的反義鏈幾乎不能與EZH2蛋白結合。此外，western blot檢測PiHL過表達和干擾后EZH2的表達變化，結果顯示在DLD1和HCT116細胞中，PiHL表達水平的改變并不直接影響EZH2蛋白的表達水平(圖9)。為了進一步鑒定涉及PiHL參與表觀遺傳調控過程的基因，利用構建的干擾PiHL表達HCT116細胞和對照HCT116細胞進行RNA測序，結果顯示，PiHL敲除后存在大量差異表達的基因。在火山圖分析中，鑒定出多個與其表達水平相差2倍以上及P<0.001的基因，其中包括多個重要的PRC2靶基因。在奧沙利鉑耐藥的HCT116、DLD1細胞中干擾PiHL并使用qRT-PCR進一步驗證，結果顯示在HCT116、DLD1細胞中干擾PiHL表達后抑癌基因CDKN2B、KLF2、KLF6、RUNX3表達顯著上調(圖10)。

圖7 TCGA數據庫中PiHL與PRC2組分的相關性

圖8 RNA pull-down結合western blot檢測PiHL與EZH2蛋白的結合

圖9 western blot檢測PiHL對EZH2蛋白的調控作用

注：A，基因火山圖；B,部分基因熱圖；C、D，qRT-PCR檢測干擾PiHL表達后細胞中PRC2靶基因的表達；與對照組相比，*，P<0.05；**，P<0.01。

3 討論

在本研究中，筆者根據PiHL在結直腸癌細胞中呈高表達且其表達水平與結直腸癌腫瘤體積和患者預后相關，進而提出了PiHL可能參與介導結直腸癌耐藥的假設。由于不同細胞系TP53、KRAS等重要基因的突變背景不同，可能對藥物敏感性產生一定影響，為了進一步確定PiHL在細胞耐藥中的功能，本實驗利用4種結直腸癌細胞通過體外持續誘導的方式構建了其對應的穩定的奧沙利鉑耐藥細胞系，并檢測了親本和耐藥細胞系中PiHL的表達水平。結果顯示，PiHL在耐藥細胞系HCT116-oxa、DLD1-oxa、SW620-oxa、SW480-oxa中的表達水平顯著高于正常細胞，提示PiHL可能參與了奧沙利鉑的耐藥機制并對腫瘤耐藥起到促進作用。為明確PiHL在結直腸癌奧沙利鉑耐藥中的功能，筆者進一步通過試驗得出穩定過表達PiHL可以增加細胞在奧沙利鉑處理后的存活率，減少奧沙利鉑誘導的細胞凋亡；耐藥細胞敲除PiHL后細胞存活率明顯低于對照組，藥物誘導的凋亡比例顯著增高，提示PiHL可能保護結直腸癌細胞免受奧沙利鉑誘導的凋亡。以上數據均進一步證實PiHL的表達水平影響細胞對奧沙利鉑的敏感性，PiHL表達上調可以促進結直腸癌細胞耐藥，PiHL表達缺失則對細胞耐藥起負向調節作用。

近年來，LncRNA被認為是PRC2功能的重要參與者，細胞核內LncRNA通過與PRC2結合，調控下游基因的表達，在多種生物學過程中發揮重要作用[7]。筆者對TCGA數據庫中結直腸癌組織樣本進行分析，發現PiHL表達和PRC2的組成成分EZH2、SUZ12、EED的表達存在顯著正相關。qRT-PCR分析結直腸癌組織樣本中的基因表達情況也證實癌組織中PiHL的表達水平與EZH2呈正相關，提示PiHL可能參與PRC2介導的表觀遺傳調控機制。為了驗證假設，筆者在HCT116細胞中使用EZH2抗體進行RNA pull-down及western blot，結果顯示體外轉錄的LncRNA PiHL可以與細胞中的EZH2蛋白直接結合。同時，western blot結果顯示,PiHL并不直接調控EZH2蛋白的表達，表明PiHL通過與EZH2結合參與表觀遺傳調控機制。為了進一步鑒定涉及PiHL參與表觀遺傳調控過程的基因，筆者對干擾PiHL表達的HCT116細胞和對照HCT116細胞進行RNA測序分析，結果顯示PiHL敲除后存在大量差異表達的基因，這些變化的基因中包括多個重要的PRC2靶基因。研究報道，多個腫瘤抑制基因如KLF2、RUNX3、CDH1、CDKN1C、CDKN2B、P14和P16等參與PRC2介導的癌癥進展[8-10]。筆者通過閱讀文獻和qRT-PCR進一步篩選和驗證，結果顯示，與對照組細胞相比，PiHL表達下調顯著增加了CDKN2B、KLF2、KLF6、RUNX3等基因的表達。結合上述文獻結果，證實了結直腸癌細胞中PiHL的表達水平與對奧沙利鉑的敏感性有關，PiHL的高表達可以抑制奧沙利鉑誘導的細胞凋亡，促進結直腸癌細胞對奧沙利鉑耐藥。PiHL通過與多梳抑制復合物中EZH2蛋白結合表觀遺傳沉默重要的抑癌基因CDKN2B、KLF2、KLF6、RUNX3的表達，可能是結直腸癌細胞中奧沙利鉑耐藥的重要機制。在將來的研究中，筆者將通過回顧性實驗進一步證實EZH2對這些抑癌基因的調控關系，并且在臨床樣本中探討LncRNA PiHL的應用價值。