Rac1在食管鱗狀細胞癌中的研究進展

郭麗媛，張金業

(1.南通大學醫學院，江蘇南通 226001；2.南通大學附屬腫瘤醫院檢驗科，江蘇南通 226001)

食管癌具有高發病率、高致死率的特征，是臨床上常見的惡性腫瘤之一[1]。從組織學類型上，食管癌可分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)。盡管食管癌的治療方法不斷進步，但依據癌癥中心數據顯示，食管癌5年生存率僅為20%[2]。目前臨床上ESCC尚未有明確的分子靶向藥物，因此，需進一步尋找更有效的腫瘤標志物以實現早診斷、早治療，降低患者死亡率。Ras相關的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)作為Rho家族成員之一，是一種鳥嘌呤核苷酸激活蛋白(GTP)酶[3]。研究表明，Rac1在乳腺癌、肝癌和肺癌等腫瘤中呈高表達，且與預后不良有關，可作為有效的治療靶點[4-6]。近年來研究發現，Rac1在ESCC中呈高表達，并與ESCC的發生、發展和轉移密切相關[7]。本文就 Rac1在ESCC發生、發展和轉移過程中的分子調控機制、Rac1基因的檢測技術以及臨床治療中的應用作一綜述。

1 Rac1的結構及功能

Rac1基因位于人染色體7p22，含有7個外顯子和3個內含子。該基因編碼的蛋白質是GTP酶(GTPase)，屬于小GTP結合蛋白Ras超家族[8]。該超家族的成員調控著一系列不同的細胞事件進程，包括控制細胞生長、細胞骨架重組和蛋白激酶的激活等。Rac1蛋白包括核苷酸結合位點、開關一、開關二、多堿基區和C-末端膜靶向區域5個結構域，任意1個出現錯義突變即可導致腫瘤的發生。Rac1有2種存在形式，分別為可被鳥嘌呤核苷酸交換因子激活至 GTP 結合狀態，以及被GTPase失活至 GDP 結合狀態。在其 GTP結合狀態下，在多種細胞互相作用的過程(如細胞的生長、轉移、侵襲、凋亡、周期調控和細胞骨架重組等)中起著重要作用[9]。Rac1 及其細胞信號網絡可對腫瘤產生以下5種作用：抗凋亡、促增殖、轉移相關的上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)、癌癥干細胞和促血管生成。

2 Rac1檢測技術的研究進展

研究表明，Rac1表達的量及活性均影響腫瘤的發生、發展。因此，Rac1的早期檢測可為腫瘤的診治提供重要的臨床應用價值。

2.1Rac1蛋白和基因表達的檢測技術 主要包括：實時熒光定量RT-PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、免疫組織化學染色(immunohistochemistry,IHC)、蛋白質免疫印跡(western blot)技術以及免疫熒光技術(immunofluorescence，IF)。IHC、western blot、IF都是利用抗原抗體反應對基因進行定量或定位的檢測手段，檢測方法較簡單，特異性高，定位準確，但對儀器的要求比較高。例如，Yang等[7]采用RT-PCR、western blot和IHC技術發現Rac1在ESCC組織中的蛋白質及基因水平的表達上調，并且證實了Rac1的高表達與腫瘤的侵犯深度、淋巴結轉移和低存活率相關。Yuan等[10]采用IF技術證實了Rac1在ESCC細胞中主要定位于細胞質，并發現Rac1越聚集在細胞膜前緣，則腫瘤細胞的遷移能力越強。對Rac1檢測定量分析最準確的檢測方法是qRT-PCR，該技術的靈敏度高、準確性強，但qRT-PCR結果的影響因素很多，如重復洗滌、離心、純化等步驟均可造成相當數量的核酸損失。目前開發的基于液滴的數字PCR(dPCR)技術可避免上述缺陷，在 dPCR中，樣品被稀釋，每個單獨的分區包含不超過1個目標序列，dPCR提供了絕對值和可分析的定量數據，極大地提高了稀有序列檢測的靈敏度、特異性，克服了腫瘤細胞低核酸的缺點[11]。目前國內尚未見采用dPCR檢測ESCC患者Rac1表達的研究報道。尚需更深層次研究，為在早期階段檢測腫瘤標志物提供實驗依據。

2.2Rac1活性的檢測技術 谷胱苷肽巰基轉移酶下拉法(Glutathione-S-transferase pull down assay，GST pull down assay)是目前臨床上常用的檢測Rac1活性的方法。GTS-pull down法主要利用某些蛋白質的結構域能夠與GTP-Rac1相結合的特性，構建出該結構域的GST融合蛋白，通過GST-pull down方法富集激活形式的Rac1，并且能夠動態反映細胞內Rac1的活性變化，具有較高的準確性和特異性，但偶爾會出現假陽性結果[12]。Yuan等[10]采用GTS-pull down法檢測Rac1在ESCC組織中的活性，證實Rac1活性越高，遷移能力則越強。其進一步研究發現，Rac1與腫瘤的進展呈正相關，且在發生腫瘤轉移的患者中，Rac1的表達水平比未發生轉移患者明顯升高，且預后較差。但由于現有檢測技術的限制，尚未見在外周血中能檢測Rac1的活性變化的報道。因此，還需進一步深入研究Rac1活性的檢測技術及臨床應用價值。

3 Rac1與ESCC的發生、發展及轉移

3.1Rac1促進ESCC發生、發展和轉移 Rac1蛋白高表達與Rac1基因突變及活性異常有關。有學者發現，Rac1突變體的形成及其上游分子異常啟動可使活性增強，從而啟動一系列信號通路，導致腫瘤的發生、發展[13]。另有研究表明，小GTPase Rac1參與了F-肌動蛋白和黏著斑動力學，導致肌動蛋白在前沿聚合產生突起，過度激活的Rac1可增強細胞遷移[14]。肌動蛋白細胞骨架動態組裝成絲狀體和微梭形結構啟動了細胞遷移，Rac1的表達和激活可促進此進程。此外，EMT與腫瘤的轉移密切相關。目前研究表明，Rac1與EMT關系密切，Rac1可通過以下幾種途徑實現EMT，從而促進腫瘤的轉移，包括：其上游效應物過表達/過活性(生長因子)；下游效應物激活P21活化蛋白激酶(p21-activated kinases，PAK)；Rac1活性增加；間接變異體(如Rac1b)表達；上調Wnt/β-連環蛋白途徑；激活轉錄激活因子3；促進肌動蛋白細胞骨架片狀足形成；促進活性氧類(reactive oxygen species，ROS)產物形成及應激反應蛋白(如p38)的激活[9]。通過以上機制，Rac1不僅促進腫瘤細胞的生長、發展，也促進了腫瘤的轉移。

3.2Rac1促進ESCC轉移的信號通路 有學者發現，一種新的天然大環內酯F806可下調Rho家族(CDC42、Rac1)的表達和活性，從而中斷F-肌動蛋白遷移成分的組裝，抑制癌癥的侵襲和轉移[15]。另有研究發現，在ESCC中，Rac1的表達受趨化因子基質細胞衍生因子-1的趨化因子受體(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)的調節，敲低CXCR4可顯著抑制AKT和ERK的磷酸化以降低Rac1蛋白的水平，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移[16-17]。研究證實，微小核糖核酸(miRNA)在細胞增殖、細胞生長、凋亡、DNA修復、侵襲、血管生成、轉移和耐藥中均具有重要作用[18]。Ma等[19]研究發現，MicroRNA-92b在ESCC中呈高表達，且與淋巴結轉移呈負相關，其進一步證實MicroRNA-92b可通過抑制整合素αV 的表達發揮其抑制功能，降低了磷酸化黏著斑激和Rac1的激活，從而影響侵襲與遷移。Tanabe等[20]通過免疫組織化學證實，Rac1的活性受絲狀蛋白C(filamin C，FLNC)的調節，FLNC在ESCC中的表達與淋巴侵襲、轉移和預后有關，FLNC可激活Rac1，使細胞侵襲、遷移能力增強。Wen-Jian等[21]發現，在ESCC中，14-3-3ε基因與T 淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1的結合可促進Rac1的激活。Wang等[22]發現，球姜酮(Zerumbon,ZER)可通過促進Rac1泛素化，導致Rac1的降解，抑制ESCC的遷移。以上研究證實，Rac1對ESCC的影響主要為上游分子導致Rac1的激活或表達增加，從而促進腫瘤轉移，如若Rac1降解，則對腫瘤的進程產生抑制作用。

4 Rac1在抗腫瘤治療中的應用

研究表明，Rac1抑制劑在抗腫瘤的療效評價中具有較高的臨床應用價值，針對Rac1的放化療方案、靶向治療及免疫治療均取得了較好的療效[23]。Rac1抑制可逆轉乳腺癌的順鉑耐藥[24]；在非小細胞肺癌中，Rac1誘導的EMT與增強的癌細胞遷移和侵襲相關，并與放療抵抗密切相關[25]；對于靶向治療，Rac1的激活可增加肺癌對吉非替尼的耐藥性[26]。此外，研究表明，抑制Rac1能夠阻礙腫瘤細胞的免疫逃逸[27]。由此可見，Rac1抑制劑在腫瘤治療中具有重要的臨床應用價值。Xu等[28]發現，整合素β1通過調節FAK-Rac1信號通路促進細胞活性，并下調ESCC細胞對順鉑的敏感性，表明整合素β1可作為ESCC治療靶點。筆者推測，阻斷Rac1信號通道的傳導可增強ESCC對順鉑的敏感性，但尚需進一步的臨床研究證實。

5 小結及展望

RAC1廣泛表達于腫瘤細胞中，Rac1的突變與活性異常在ESCC的發生、發展及轉移中發揮重要的作用。隨著檢測技術的不斷進步，目前已開發出多種技術用于Rac1的表達及活性的檢測，但仍需要研發新型檢測技術以提高Rac1的檢出率，為早期診斷和早期治療提供新的依據。通過研究Rac1的結構、功能及其調控的信號通路，有望為ESCC分子靶向藥物治療提供新途徑。因此，對Rac1進行更深層次的認識及靶向調控的研究，可為新型抗腫瘤靶向藥物的開發提供重要的實驗依據，為ESCC的臨床治療提供更多的選擇，為改善腫瘤患者病情及提高存活率帶來新希望。