血漿細胞外囊泡分離方法的研究進展

廖昕萌，潘煒倫，馮俊杰，李博

(南方醫科大學南方醫院檢驗醫學科，廣州 510515)

細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是活細胞分泌到細胞外的膜性囊泡，依據粒徑和來源可將其分為：外泌體、微囊泡和凋亡小體[1]。EVs內含有多種生物分子，可參與細胞間信息交流，并反映疾病狀況以輔助臨床診斷和治療[2]。EVs廣泛分布于血漿、尿液、腦脊液等各類體液[3]，其中血漿標本因具有采集、處理和保存的方法成熟、取材方便、EVs含量豐富(108～1013顆粒/mL)[3]、不同生理和病理條件下EVs數量及其內容物含量差異大等特點，故而血漿EVs在疾病的早期診斷、療效監測和預后判斷中具有極大優勢，成為了近年來研究的熱點。但血漿EVs的傳統分離方法受到多種血漿成分的干擾，難以實現EVs的高效分離，因此，近年來發展了許多新型分離方法以應對傳統血漿EVs分離遇到的難題。本文將分析傳統血漿EVs分離和鑒定方法，并重點從新型親和法、微流控法和聯合應用法3個方面介紹新型分離方法的研究進展，以期為血漿EVs分離方法的發展提供參考和借鑒。

1 傳統的血漿EVs分離和鑒定方法

傳統的血漿EVs分離方法包括超速離心法(ultracentrifuge, UC)、超濾法(ultrafiltration, UF)、沉淀法(precipitation)、色譜法(size exclusion chromatography, SEC)和免疫親和法(immunoaffinity)等(表1)。由于受到血漿中多種復雜成分的干擾，使用傳統方法分離血漿EVs存在分離效率低、純度低、特異性低、EVs受損變性或生物活性低等缺陷，因此，分離后常需使用多種鑒定方法從不同維度驗證分離產物(表2)。

表1 常用的傳統血漿EVs分離方法

表2 常用的血漿EVs鑒定方法

2 新型血漿EVs分離方法

如今許多新型血漿EVs分離方法能克服傳統分離方法的缺陷，實現血漿EVs快速分離，并提高產率、純度和特異性，滿足多種應用的需求。常見的新型血漿EVs分離方法包括：(1)新型親和法；(2)微流控法；(3)聯合應用法。

2.1新型親和法 親和法因高度特異性而被廣泛用于血漿EVs的分離，利于不同疾病的深入研究(表3)。除了免疫親和法外，脂質親和法和二氧化鈦(TiO2)親和法也是近年來血漿EVs分離的新策略。此外，親和法中的配體也可以是適配體、多肽類、跨膜蛋白和肝素。

表3 新型親和法在血漿EVs分離中的應用

然而，所有親和法都存在一定局限性：(1)截至目前，沒有研究發現存在于所有EVs的通用型表面標志物，因此，表面標志物的數量和表達量會影響分離產率，使得產率小于實際樣本中的EVs數量，導致EVs所含的重要信息在后續檢測中被遺漏；(2)許多疾病的特異性表面生物學標志物依舊未知，故而無法通過親和法進行相關疾病的EVs分離[24]；(3)特異性結合物會破壞EVs的生物活性和功能，影響其下游實驗的檢測和應用；(4)血漿中的雜質蛋白會與配體、反應板或EVs表面多個競爭性結合位點發生非特異性結合，導致EVs的捕獲率、釋放率和分離純度降低；(5)試劑和材料成本較高，難以在臨床應用中推廣和普及。

2.2微流控法 近年來血漿EVs分離方法發展的主流趨勢是建立微流控分離平臺。這種分離方法通過結合聲學、電泳或電磁場等先進技術，根據EVs的物理和生化特性實現高通量的非接觸式分離(表4)。該方法無需特殊的生物學標志物，產率較高，能保護EVs的結構、內容物和功能不受破壞，實現分級分離，是血漿EVs分析實驗前處理的理想方法。同時，微流控分離法能將血漿EVs的分離、表征和檢測同時結合在單個裝置上，實現其研究的集成化和一體化。雖然目前微流控分離法仍缺乏成熟的行業標準和規范，且分離效果易受實驗試劑和外界環境的影響[25]，但其體積小、分離樣本量下限低、自動化程度高等特點使它仍具有廣闊的臨床應用前景。

表4 非接觸式微流控平臺在血漿EVs分離中的應用

2.3聯合應用方法 血漿EVs的分離方法各有優缺點，適用于不同的標本類型，為了彌補單一方法的局限性，目前許多研究聯合使用多種分離方法以達到更優的分離效果(表5)。通常情況下，UC、UF作為血漿EVs分離策略的前幾步驟，用于去除血漿中的死細胞、細胞碎片等大顆粒雜質，而SEC、沉淀法等則用于后續EVs的純化分離，如Koh等[32]先用UC濾除血漿中大分子物質，再用SEC濾除可溶性蛋白質，該聯合方法的產率、雜質蛋白清除率均明顯高于單獨使用UC或SEC。近年來，許多研究也將新舊分離方法相結合，不僅能延續傳統方法的優勢，實現更快速、精準的分離，也能讓分離平臺更加小型化、便攜化，利于分離方法在臨床應用中的發展。不過，雖然聯合應用方法能取長補短，但往往操作步驟繁瑣，分離過程中EVs的損失較多，分離產率不理想。

表5 聯合應用方法在血漿EVs分離中的應用

3 血漿EVs分離面臨的挑戰

截至目前，仍然沒有一種分離方法能適用于所有血漿EVs的研究目的，也無法完全去除血漿中干擾物質對EVs分離的影響，分離血漿EVs仍存在許多困難和挑戰。血漿EVs分離過程中常見的干擾物質有血漿蛋白、脂蛋白、游離核酸等生物有機大分子，而一些細胞、細胞碎片和病毒顆粒[39]因形態和體積與EVs相似，也會影響UC、UF和SEC等物理分離方法。此外，血漿的粘度、密度和離子強度等環境因素會影響部分微流控分離法。這些干擾因素都使得在分離血漿EVs時需要更謹慎地選擇分離方法。

由于下游研究目的不同，導致實驗對EVs純度、來源和產量等要求不同，故而樣本類型、采集和前處理方法對于分離臨床樣本中的血漿EVs也至關重要。血液中多數的EVs由血小板釋放產生，血液凝固、采血針孔過小和反復凍融操作等都極易誘發血小板釋放EVs[40]。因此，如果需要研究血小板EVs或下游實驗需要大量囊泡結構，則選用血清樣本進行EVs分離會更高效；而如果要檢測特定類型的疾病特異性EVs亞群，則推薦選用血漿樣本，以最大程度去除血小板EVs，并避免血小板持續產生EVs而導致后續分析出現錯誤結果[41]，還原樣本中最接近實際情況的EVs濃度和比例。此外，臨床標本采集中使用的抗凝劑也會影響血漿EVs的分離和鑒定，如肝素能與EVs結合、促進血小板活化及抑制PCR反應[42]。雖然國際血栓和止血協會(International Society on Thrombosis and Haemostasis)推薦選用檸檬酸鹽作為血漿EVs研究時的抗凝劑[43]，但其抑制血小板活化的效果弱于乙二胺四乙酸(EDTA)和ACD抗凝劑[44]。因此，應具體根據下游分析和實驗目的選擇合適的抗凝劑。

4 總結與展望

血漿EVs 在疾病檢測、診斷、治療、預后和藥物傳遞中的應用潛力已被許多研究證實[45]。傳統EVs分離方法已經不再能滿足研究的需求，人們對EVs研究興趣的增長又促使許多先進新型分離方法的誕生。由于各類方法具有不同的分離原理和步驟，為了能更高質量地獲得所需的EVs，聯合應用方法已成為許多研究的共同趨勢。而根據實驗目的選擇合適的分離方法，可以大大減少血漿EVs分離過程中的主要干擾因素，更有效地接駁后續分析研究和下游應用，例如：(1)UC、UF和微流控法的產率較高，適用于血漿EVs需求量大的研究；(2)免疫親和法的產物純度和特異性高，適用于血漿中特定EVs表面標志物的研究；(3)SEC、微流控法和免疫親和法的血漿蛋白和脂蛋白清除率高，適用于篩選血漿EVs蛋白標志物；(4)微流控法的產物結構相對完整、粒徑均一[27]，且產物核酸含量能滿足后續檢測的需求[9]，適用于血漿EVs的表征等受物質形態影響較大的研究，也適用于疾病的基因分析，利于疾病早期篩查。而隨著現代生物技術不斷進步，血漿EVs分離方法在未來也會持續推陳出新，大力推動EVs研究和“液體活檢”的發展。