FXYD3在宮頸鱗癌患者組織中的表達及與臨床病理參數的關系

馬學玲，蔡海瑜，車艷紅，劉星爍

(鄭州市婦幼保健院a.婦科，b.婦科腫瘤病區，鄭州 450052)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，以宮頸鱗癌較為多發，近來發病呈年輕化趨勢，危害嚴重[1]。早期確診患者的5年生存率可達90%，但晚期多發生浸潤、轉移，患者預后差，Ⅳ期患者的5年生存率不足20%[2]。宮頸癌發病機制復雜，探究與發病機制相關的分子標志物對宮頸癌的病情監測具有重要意義。FXYD3蛋白(domain-containing ion transport regulator3 precursor)是FXYD蛋白質家族成員，以脯氨酸-苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸(PFXYD)而得名，又稱為乳腺腫瘤標志物(MAT-8)，其可通過調節Na+-K+泵，參與細胞內環境代謝及穩態調節。研究發現，FXYD3在乳腺癌[3]、前列腺癌[4]等多種癌癥中的表達上調，并與腫瘤惡性程度呈正相關。然而，關于FXYD3在宮頸鱗癌中表達情況的報道少見。雖然不同腫瘤的異質性極大的影響了相關腫瘤分子標志物的表達、患者治療、預后及復發等，但不同腫瘤之間亦存在相似性，研究腫瘤異質性及相似性可加深對腫瘤發生、發展機制的認知[5]。因此，本研究選取FXYD3基因為研究對象，通過生物信息學數據庫及免疫組化染色法分析FXYD3在正常宮頸組織及宮頸鱗癌組織中的表達情況，并初步探討其與宮頸鱗癌患者臨床病理參數的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 收集2015年9月至2018年1月于鄭州市婦幼保健院婦科收治的65例宮頸鱗癌患者癌組織標本，年齡(46.92±10.35)歲，腫瘤臨床(FIGO)分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期32例，Ⅲ期13例，Ⅳ期5例；病理分級：Ⅰ級12例，Ⅱ級39例，Ⅲ級14例；淋巴結轉移者26例，未轉移者39例。納入標準：(1)符合國際婦產科聯盟(FIGO)宮頸鱗癌診斷標準[6]；(2)均行手術切除，術前均未進行放化療等抗腫瘤治療，術后均經組織病理學證實為宮頸鱗癌；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤者；(2)合并基礎性疾病或慢性感染性疾病者。另取同期50例本院保存的因子宮肌瘤行子宮全切術的正常宮頸組織標本作為對照組，年齡(46.41±11.08)歲，均經超聲和病理檢查確診為子宮肌瘤[7]。本研究通過鄭州市婦幼保健院醫學倫理委員會審核批準[倫理批文：2015-(倫)009)]。患者出院后通過門診復查、電話等方式對患者進行隨訪，記錄患者生存時間(overall survival，OS)。本次隨訪截止日期為2020年12月。

1.2儀器與試劑 NanoDrop 2000c 超微量紫外分光光度計、905-ULT超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司)，CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。RNA提取試劑盒(北京天根公司)，反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，兔抗人FXYD3多克隆抗體、生物素標記的羊抗兔IgG二抗(英國Abcam公司)，DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)。

1.3方法

1.3.1數據庫挖掘分析 使用TCGA門戶網站的UALCAN數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)深入分析31種癌癥類型的RNA測序數據及臨床數據。從TCGA數據庫(https://www.cancer.gov)下載宮頸鱗癌對應的mRNA表達RNASeq數據及臨床數據。GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析來自TCGA和GTEX數據庫中樣本的RNA測序表達數據。下載GTEX數據庫(https://commonfund.nih.gov/gtex)中正常宮頸組織的RNA Seq數據及臨床數據，基于以上2種數據庫，篩選存在FXYD3mRNA表達的宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織樣本，分析FXYD3在宮頸鱗癌(CESC)組織及正常宮頸組織中的表達差異。

1.3.2RNA提取及逆轉錄反應 按照RNA提取試劑盒說明書對宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織標本(各60 mg)中的總RNA進行提取。NanoDrop 2000c 分光光度計檢測RNA濃度，取吸光度(A260 nm/A280 nm)值在1.8～2.0間的樣本，置于-80 ℃保存。按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄成cDNA，置于-20 ℃保存。

1.3.3引物設計及實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 參照GenBank中各基因的序列號(FXYD3序列號為NC_000019.10、GAPDH序列號為NC_000012.12)，引物設計參照文獻[8]，并由上海生工公司合成。FXYD3上游引物序列:5′-CCTGTCCTGGACGCCAAT-3′，下游引物序列:5′-GAGGCTGTGCCAGTCATAGTAGAA-3′，退火溫度61 ℃，產物片段大小243 bp；GAPDH上游引物序列:5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，下游引物序列:5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。qRT-PCR反應體系共25 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，滅菌水8.5 μL。反應條件：預變性95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共35個循環;72 ℃時采集熒光信號。以GAPDH為內參基因，2-ΔΔCt法計算FXYD3mRNA的相對表達量，計算公式：ΔΔCt=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct內參基因)-(對照Ct目的基因-對照Ct內參基因)]。

1.3.4免疫組化染色法檢測FXYD3蛋白表達 石蠟組織切片標本常規脫蠟至水，修復抗原，加入6%的正常山羊血清室溫封閉30 min，加入50 μL兔抗人FXYD3多克隆抗體(1∶100稀釋)4 ℃過夜，PBS洗滌3次，加入生物素標記的羊抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃溫育1 h，PBS洗滌3次，DAB染色5 min，蘇木素復染，鹽酸酒精短暫分化后，脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定:由2名資深病理醫師采用雙盲法分別對染色結果進行半定量評分。細胞質或核內呈黃色或棕色顆粒為陽性染色，采用免疫反應積分(IRS)法進行評分：染色強度(SI)積分，無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性染色細胞百分比(PP)積分，陰性記0分，PP 1%～10%記1分，PP 11%～50%記2分，PP 51%～75%記3分，PP 76%～100%記4分。IRS = SI積分×PP積分，IRS≥3為陽性，IRS<3為陰性。

1.3.5FXYD3共表達基因分析 基于cBioPortal數據庫(https://www.cbioportal.org/)，選取相關系數r>0.3且P<0.05的基因。進一步將其導入Enrichr網站(http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr)進行共表達基因的富集分析，選擇顯著相關通路，采用ImageGP(http://www.ehbio.com/Cloud_Platform/front/)在線軟件進行信號通路富集分析，以氣泡圖形式呈現富集結果。

1.3.6FXYD3蛋白互作分析 STRING數據庫(https://string-db.org/)是一種用于識別已知蛋白質和預測蛋白質之間相互作用的軟件系統。基于STRING數據庫對FXYD3蛋白進行蛋白質互作分析，繪制蛋白質互作網絡圖。

2 結果

2.1FXYD3在宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的表達差異 UALCAN數據庫中共分析了3例正常宮頸組織及305例宮頸鱗癌組織中FXYD3的表達，結果顯示宮頸鱗癌組織中FXYD3的表達水平[8.921(8.287，9.400)]顯著高于正常宮頸組織[0.995(0.346，5.837)]，差異有統計學意義(Z=-0.205，P<0.05)。進一步比較GEPIA數據庫中13例正常宮頸組織[3.269(2.720，7.820)]及306例宮頸鱗癌組織[10.244(9.569，10.749)]FXYD3的表達量，結果顯示宮頸鱗癌組織中FXYD3的表達水平亦顯著高于正常宮頸組織(Z=-6.107，P<0.05)。

2.2FXYD3mRNA在宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的表達 qRT-PCR結果顯示，FXYD3mRNA在50例正常宮頸組織中的表達量為1.00±0.00，在65例宮頸鱗癌組織中的表達量為1.68±0.32，FXYD3mRNA在宮頸鱗癌組織中的表達量顯著高于正常宮頸組織(t=15.011，P<0.05)。

2.3FXYD3蛋白在宮頸鱗癌組織及正常宮頸組織中的表達 免疫組化染色結果顯示，FXYD3蛋白主要定位于細胞質或(和)細胞膜上。宮頸鱗癌組織中FXYD3陽性表達率為63.08%(41/65)，顯著高于正常宮頸組織的28.00%(14/50)，差異有統計學意義(χ2=13.935，P<0.05)。

2.4FXYD3表達與宮頸鱗癌患者臨床病理參數的關系 基于UALCAN數據庫分析FXYD3與宮頸鱗癌患者臨床病理參數的關系，結果顯示FXYD3在不同組織類型中的表達差異有統計學意義(P<0.05，圖1E)，在不同年齡、體重、種族、癌癥分期、腫瘤分級、淋巴結轉移類型中的表達差異無統計學意義(P>0.05,圖1A～F)。本研究基于選取病例中FXYD3的表達情況，分析其與宮頸癌患者臨床病理參數的關系，結果顯示FXYD3蛋白的表達與年齡、病理分級均無關(P>0.05)，而與組織類型、臨床分期、淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表1。

注：A，不同年齡；B，不同體重；C，不同種族；D，不同癌癥分期；E，不同組織類型；F，不同腫瘤分級；G，不同淋巴結轉移。

表1 FXYD3表達與宮頸鱗癌患者臨床病理參數的關系[n(%)]

2.5FXYD3蛋白表達與宮頸鱗癌患者預后的關系 FXYD3蛋白陽性表達患者的平均生存時間(OS)顯著低于陰性表達患者(38.12個月 vs 53.56個月，χ2=5.485，P=0.019)。

2.6FXYD3蛋白互作共表達分析 通過STRING網站在線繪制FXYD3蛋白互作網絡圖，根據相關性評分分析結果顯示，相關性較強的前5個蛋白質分別為ATP1B1、ATP1B2、ATP1B3、ATP1A1、ATP1A2(圖2)。

圖2 FXYD3蛋白互作網絡圖

2.7FXYD3共表達基因通路富集分析 通過cBioPortal數據庫，預測分析出417個與FXYD3共表達基因，表2為與FXYD3基因相關性較強的前5個基因。將共表達基因輸入Enrichr網站進行通路富集分析，選擇有顯著差異的前20條，采用ImageGP在線網站繪制氣泡圖(圖3)，結果顯示，FXYD3共表達基因富集到的主要通路包括T細胞受體、B細胞受體、白細胞介素-17、趨化因子信號通路，氧化應激信號通路，非小細胞肺癌、膀胱癌等癌癥信號通路，蛋白質水解、核黃素代謝、核酸合成代謝等信號通路。

表2 FXYD3基因共表達分析基因

注：氣泡大小代表基因數量，氣泡顏色由紅色至藍色表示顯著性差異的P值逐漸減小。

3 討論

FXYD3定位于人類染色體19q13.11-q13.12，是最早在家鼠的乳腺癌組織中發現的一種分子量(Mr)為8 000的單跨膜蛋白質，其可通過調節Na+-K+-ATP酶改變其對Na+、K+的親和力，進而確保機體正常組織功能的運轉[9]。本研究首先采用數據庫統計分析FXYD3基因在正常宮頸組織及宮頸鱗癌組織中的差異表達情況，UALCAN數據庫、GEPIA數據庫中的統計結果均顯示，宮頸鱗癌組織中FXYD3基因的表達水平顯著高于正常宮頸組織，提示FXYD3基因可能起促癌基因作用。為進一步驗證數據庫統計結果，本研究采用qRT-PCR和免疫組化染色法檢測65例宮頸鱗癌組織標本及50例正常宮頸組織標本中FXYD3mRNA及FXYD3蛋白的表達水平，結果顯示FXYD3mRNA在宮頸鱗癌組織中的相對表達量及FXYD3蛋白陽性表達率均顯著高于正常宮頸組織，與UALCAN、GEPIA數據庫統計結果一致，提示FXYD3表達可能與宮頸鱗癌發生有關。

研究報道，FXYD3在子宮內膜癌中表達上調是子宮內膜癌進展的早期事件，與年齡、血壓、血糖和血脂水平、癌癥家族史、絕經年齡、FIGO分期、組織病理學類型、組織學分級、肌層侵犯、宮頸受累度、淋巴結轉移和生長方式無關，僅與生育頻率呈負相關[10]。本研究基于UALCAN數據庫分析FXYD3與宮頸鱗癌患者臨床病理參數的關系，結果顯示FXYD3在不同腫瘤組織類型中的表達差異有統計學意義，在不同年齡、體重、種族、癌癥分期、腫瘤分級、淋巴結轉移類型中的表達差異均無統計學意義，與Li等[10]研究結果具有相似性，但在腫瘤組織類型方面有所不同，需繼續深入探討。另有研究報道[11]，FXYD3在宮頸癌組織及細胞系中的表達上調，且與LINC01503通過競爭性結合miR-342-3p正向調控FXYD3的表達機制有關，抑制FXYD3表達可抑制宮頸癌Hela、CaSki細胞增殖、侵襲及遷移。本研究通過收集臨床資料分析發現，FXYD3陽性表達與年齡、腫瘤分級無關，而與組織類型、臨床分期、淋巴結轉移有關，與Peng等[11]研究結果類似，提示FXYD3陽性表達可能與宮頸鱗癌發生及病情程度有關。筆者進一步行生存分析結果表明，FXYD3陽性表達患者具有更短的生存時間，提示FXYD3陽性表達可能是宮頸鱗癌預后的潛在預測生物學標志物。

腫瘤的發生、發展是一個多基因、多因素參與的復雜過程，其中包括抑癌基因失活、促癌基因激活、微環境的改變等多因素相互作用。已有研究顯示，FXYD3不僅在正常人體組織中廣泛表達，而且在多種腫瘤組織中表達上調，近年來FXYD3作為一種潛在的新型癌癥生物學標志物備受關注[12-13]。本研究采用cBioPortal數據庫共預測到與FXYD3共表達的基因417個。通路富集分析顯示，FXYD3共表達基因主要參與的通路包括癌癥相關通路(非小細胞肺癌、膀胱癌及其他癌癥)，免疫、炎癥調節相關通路(T細胞、B細胞、白細胞介素-17)及各種營養代謝通路(蛋白質水解、核黃素代謝、核酸合成代謝等)，機體免疫狀態、營養水平均可影響疾病易感性[14]，提示FXYD3可能與癌癥進展密切相關，但關于其在宮頸鱗癌中的表達及作用機制研究尚處于初級階段，還需深入探究。

綜上所述，FXYD3在宮頸鱗癌組織中的表達水平顯著升高，且與宮頸鱗癌組織類型、臨床分期、淋巴結轉移及預后有關，可能成為監測宮頸鱗癌進展的有價值基因。然而，本研究僅分析了FXYD3在宮頸鱗癌組織中的表達及其與患者臨床病理參數和預后的關系，納入的宮頸鱗癌組織及正常組織樣本量較少，結果可能存在一定的局限性，是本研究不足之處。下一步我們將通過擴大樣本量，探討FXYD3在宮頸鱗癌中的臨床意義，并根據FXYD3共表達基因相關通路進行相關的基礎實驗，探討FXYD3在宮頸鱗癌發生、發展中的可能通路機制。